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sgrna载体构建详细过程
如何设计高效
的
植物
sgRNA
进行基因编辑
答:
2、基因表达
载体的构建
(1)目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传至下一代,使目的基因能够表达和发挥作用。(2)组成:目的基因+启动子+终止子+标记基因。如图:①启动子:是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA,最终获得所...
CRISPR/Cas9 设计
sgRNA
答:
利用 CRISPR/Cas9 进行基因
的
编辑,首先要
构建
有效的
sgRNA
。一般地,基因特异的 sgRNA 模板序列为位于 PAM 序列(Protospacer Adjacent Motif)前间区序列邻近基序。这是一种见于 crRNA 分子的短核苷酸基序,可以被 Cas9 蛋白特异性识别并切割的 20 个 nt。 而 PAM 序列的特征为 NGG(其中 N 为任意...
sgRNA
设计
答:
大体原则如下:(1)对于
sgRNA的
长度,一般应为20nt左右;(2)对于sgRNA序列的碱基组成,可选3'末端含GG
的sgRNA
,同时sgRNA种子序列尽量避免以4个以上的T结尾,GC%含量最佳为40%~60%;(3)sgRNA的种子序列与脱靶位点的匹配数尽可能低(4)如果
构建
U6或T7启动子驱动sgRNA的表达
载体
,...
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(6)正式转染+单克隆细胞筛选
答:
先确定目标基因 CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(1) 然后对目的基因进行背景调查 CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(2)磨刀不误砍柴工 设计sgRNA及引物 CRISPR-Cas9(三)--sgRNA设计好之后 CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(3)sgRNA及引物设计 CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(4)
构
...
CRISPR/Cas9系统基因编辑细胞实验流程是怎么样的?
答:
sgRNA
设计→表达
载体构建
→转染→筛选单克隆→敲除效率检测→病毒包装→滴度测定与感染→MOI检测
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(5)293FT细胞转染验证 and trouble shoot...
答:
1) 然后对目的基因进行背景调查 CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(2)磨刀不误砍柴工 设计sgRNA及引物 CRISPR-Cas9(三)--sgRNA设计好之后 CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(3)sgRNA及引物设计 CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(4)
构建sgRNA
+Cas9
载体
(1)sgRNA+pSpCas9...
基于CRISPR/Case9全基因组敲除文库筛选功能基因
答:
1. 文库
构建
:针对某个物种,每个基因设计3个或以上
的sgRNA
,高通量合成sgRNA,然后把合成的sgRNA克隆到慢病毒
载体
中。 2. 慢病毒转导:包装GeCKO慢病毒文库,并以低MOI(一般标准<0.3)感染靶细胞,保证一个病毒颗粒感染一个细胞,筛选同时表达sgRNA和Cas9的细胞;每个细胞都只会敲除自身携带的sgRNA对应的一个基因,细胞文库...
dCas9技术流程与实验问题解决方案
答:
1设计sgRNA 按照“20N+NGG(PAM)”的设计原理设计sgRNA,至少设计3条。2
构建sgRNA
和dCas9-target 质粒 3、构建dCas9-target稳转株 稳转株蛋白构建完成后,用flag抗体或目的蛋白抗体检测稳转株是否构建成功,如果
载体
上有荧光蛋白,可用荧光检测细胞株是否构建成功。4、Flag-ChIP-QPCR验证
sgRNA的
工作效率 1...
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(7)验证敲除--WB
答:
1) 然后对目的基因进行背景调查 CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(2)磨刀不误砍柴工 设计sgRNA及引物 CRISPR-Cas9(三)--sgRNA设计好之后 CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(3)sgRNA及引物设计 CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(4)
构建sgRNA
+Cas9
载体
转染验证 CRISPR/Cas9基因敲除...
基因敲除都需要做什么,
具体
内容
步骤
?
答:
然后我们再来看CRISPR/Cas基因敲除 CRISPR/Cas9系统中
sgRNA
(smallguideRNA)识别并结合目标基因的靶向序列,引导Cas9对结合位点进行剪切,产生DNA双链断裂(double-strandbreak,DSB),机体自身通过非同源重组(non-homologousendjoining,NHEJ)的方式修复DSB,参与修复的蛋白经常会在DNA末端插入或删除几个碱基,...
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