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western blot转膜
western
blot
为什么要
转膜
答:
主要是因为
膜
作为一个固相载体,更便于操作。蛋白胶一方面是比较易碎,不容易操作,另外蛋白在凝胶中容易扩散,不易得到理想锐利的条带。而印迹膜操作方便,比较耐用。有些比较容易做的WB实验,也有直接做in gel的,但是这个对操作要求非常高,不易实现。
Western
Blot
原理技术
答:
Western
blot
(蛋白印迹)WB是一种把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持物(NC膜或PVDF膜),并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测。WB采用抗体作为探针,抗体可以与附着在固相支持物的靶蛋白的抗原表位发生抗原-抗体免疫反应。这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物(即总蛋白混合物)...
为什么
western
blot
及southern blot电泳后都要
转膜
?
答:
western
southern其实都是要做标记的。因为样品是很多蛋白(western)或DNA(southern)的混合物,而我们只要看其中的目的条带,所以必须用特定的方法把目的条带标记出来,而其他的条带不显示(比如western的抗原抗体标记,southern的放射性自显影)。这种标记必须在膜上进行,不能直接在胶上进行,所以电泳后...
WesternBlot
基本原理及步骤
答:
(1)切胶:打开胶板,将多余的胶切掉,弃去。(2)安装
转膜
设备:取出转膜板,白板朝下,依次放入海绵、三层滤纸、NC膜、胶、三层滤纸、海绵,之后将转膜板夹紧,置于转膜槽中,倒满转膜液。(黑胶白膜:转膜夹白色部分对应着膜,黑色部分对应着胶)(3)转膜:将转膜槽与Power正确连接。设置电流为300...
western
blot转膜
后,蛋白是挂在膜表面上的,还是嵌在膜里面的?请高手解...
答:
都有可能是,蛋白转到膜上的过程是这样的:先从胶上到膜上,再慢慢往膜里移动,最终穿过膜从膜的另一侧出去,所以说具体蛋白在膜的什么位置上,跟你的
转膜
条件和蛋白的分子量大小有关系。
Western
Blot
实验我40V
转膜
11小时,时间太长了?有什么影响吗?
答:
大致上看时间不显得太长,我常常使用30V18小时.但是具体问题具体分析,如果你的目标蛋白分子量很小,你的膜孔径大,你的
转膜
缓冲液条件使得蛋白移动快或者缺乏帮助蛋白与膜结合的性质,则你仍有可能过度转膜--即蛋白穿过膜而丢失.此外,如果你的目标蛋白分子量非常大,而你的缓冲液条件不促进它的移动,则即便...
western
blot
中目的蛋白分子量<=30KDa(30KDa,24KDa,14KDa)时,电泳和...
答:
这种小分子量的蛋白 半干转就可以了 30KD 电泳条件: 我们实验室的100V恒压跑。跑到出来就可以裁胶
转膜
了。10%-12%的分离胶 半干转条件:如果裁的是2*8cm 的膜 一般是0.04mA 30-40分钟 转膜:0.45 或者0.22um size 的NC/PVDF膜 24KD 电泳条件: 我们实验室的100V恒压跑。跑到出来就...
western
blot转膜
是怎么做的?
答:
蛋白免疫印迹(
Western
Blot
) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上。目前主流方法是电转印法,分为湿式转印与半干转印。湿式转印是将胶块垂直方向夹在湿式转印槽内进行电转印。以E-Blotter湿转槽为例,一般使用垂直电泳槽的缓冲液槽体,将内部垂直电泳电极替换为...
western
blot转膜
不完全怎么办?
答:
(1)检查一下你的三明治结构夹的怎么样,尤其是膜及滤纸的边缘是不是有短接的地方,这个是最容易出现的问题。另外膜和胶之间是不是有气泡,不推荐用外力去擀压膜和胶,推荐用缓冲液润湿膜和胶之后,像做切片盖盖玻片一样从一边盖下赶出气体。要绝对确保没有短接和气泡,不然很容易出现
转膜
不完全的...
关于小分子蛋白的
Western
-
blot
问题,实验时的胶浓度,电压,
转膜
条件等等...
答:
1。当然是胶的浓度。9kda的话要适当增大,15-20%应该差不多吧。如果实在不行还能考虑用gradient gel。2。二是
转膜
缓冲液,内要含20%甲醇,新鲜配制,反复使用的话注意甲醇会蒸发掉。如果连续使用的话两三次应该还可以。甲醇一是能够洗掉跑胶时泡透了的SDS(SDS使蛋白带负电,方便移动),二是帮助...
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