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抗生素筛选阳性克隆的原理
如何快速了解接触的质粒(四)
答:
Puromycin是来源于Streptomyces alboniger的一种氨基核苷类
抗生素
,中文名为嘌呤霉素,常用于
筛选
通过质粒转染/转化、病毒感染等方法能表达pac基因(puror)的真核或原核多
克隆
或单克隆细胞。Puromycin不仅用于稳定细胞株的筛选,也用于稳定细胞株的维持。P...
目的基因与pBR322经BamH I酶切后进行重组如何
筛选
得到
阳性克隆
?
答:
质粒载体pBR322具有两种
抗生素
抗性基因——氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因,可供转化子的选择标记。把连接转化后的菌体培养物涂布在含有氨苄青霉素和四环素抗性的平板上倒置培养12~16h,长出来的单菌落进行PCR验证和酶切验证,验证为
阳性的
转化子再送去测序确认正确。为什么用单酶切呢?连反了多麻烦啊...
基因
克隆
答:
同样,使用菌落PCR和Sanger测序进行
阳性克隆
子pcDNA3.1-PVT1的
筛选
(图26)。(3) 无缝克隆 无缝
克隆的
一个重要优势是不需要考虑待克隆片段中的酶切位点情况,因此直接选择相应的酶切位点将载体线性化后,根据载体的线性化末端进行同源引物的设计,PCR扩增目的基因并纯化后直接进行重组连接和转化(图27)。以下,我们同样...
双酶切鉴定
阳性克隆
时,选择两种内切酶的依据是?
答:
:载体自身环化效率过高、琼脂平板上的
抗生素
失活或含量过低、载体 DNA 与插入片段 的分子比率过高
载体构建的基本流程
答:
然后,对重组子进行
筛选
与鉴定。由于转化实验中会产生大量的非重组子和假
阳性克隆
,因此需要通过筛选和鉴定来获取真正的阳性克隆。常用的筛选方法包括
抗生素
抗性筛选、分子杂交筛选等。鉴定方法则包括PCR鉴定、酶切鉴定、测序鉴定等。最后,对重组载体进行扩增和纯化。一旦获得了阳性克隆,就需要对其进行扩增,...
如何用标记基因检测目的基因导入载体
答:
一般标记基因的DNA序列是已知的,若选用抗氨苄青霉素基因,则可在目的基因导入后用氨苄青霉素来处理受体细胞,若无异常,则抗氨苄青霉素已合成,说明基因已得到表达。标记基因的作用在于便于检测目的基因的情况。因为标记基因和目的基因同位于运载体上,要导入都导入,要表达则都会表达。检测分三种,首先是通过...
...只要质粒上含有
抗生素
基因就能在抗生素培养液中生存,如果没表达呢...
答:
所以只要菌体内有这种带上了抗抗生素基因的质粒,菌就可以抵抗抗生素对它的毒杀作用,就可以生存。我们是将目的基因在质粒的多
克隆
位点(MCS)处连接,成为重组质粒,质粒上要有相应的标记基因以方便
筛选
转化子,一般就是用抗生素抗性基因,在含有
抗生素的
选择培养基中培养菌体就可筛选出成功导入质粒的菌落...
...
抗生素的
一种,添加到培养基中,用来
筛选阳性克隆的
。
答:
羧苄青霉素,常用作除杂菌的
抗生素
,也有用作抗性
阳性
菌落的
筛选
,但这要看你所用载体的抗性
...是否进入受体细胞?老师讲的是标记基因,具体步骤
是什么
?
答:
在原核
克隆
过程中:最常用的是抗性
筛选
:载体上具有某种或某几种抗生素抗性基因,转化之后涂布在含有该
抗生素的
平板上,能长的就是载体进入了的细胞。挑选之后可以再利用菌落PCR或者扩增之后酶切,以鉴定目的基因是否也重组进去了,以排除载体自连的空载。最后用测序的方法检测是否有突变产生。还有蓝白班筛选...
怎样降低转基因食物的危害
答:
个人认为转基因中目前最大的危害为:转基因工程用于
阳性克隆的
抗性
筛选
时使用的
抗生素
,人体若常时间累计食用,可能会引起抗药性增高;说白了就是:转基因时使用到了大量的各种抗性药物,人类长期食用转基因食物可能以后生病的时候会有一个现象---很多药都治疗不好。要降低转基因食物危害,就要从转基因的技...
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