第1个回答 2022-06-10
“ SnapGene是构建质粒的利器。 ”
上次介绍了双酶切克隆和TA克隆，这次介绍一种和TA克隆比较相似的TOPO克隆，唯一的区别就是TA克隆用的是T4连接酶把PCR片断连接到T载体上，而TOPO克隆是基于拓扑异构酶(Toposiomerase)的克隆，是一种不利用限制酶和连接酶的DNA克隆方法，该技术依赖于A和T碱基的互补配对，因此也可以称为TOPO-TA，用于黏性末端；当然也可用于平末端的连接。
这一部分以PDCD-1(程序性死亡受体1)为目的片段，使用TOPO克隆方式进行构建目的载体。
1. TOPO克隆作用机制
拓扑异构酶(Toposiomerase)是存在于细胞核内的一类酶，他们能够催化DNA链的断裂和结合，从而控制DNA的拓扑结构，拓扑异构酶参与了超螺旋结构模版的调节。
PCR反应中所使用的聚合酶具有末端转移的活性，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。TOPO克隆使用了牛痘病毒中分离出的拓扑异构酶I，识别DNA序列5'-(C/T)CCTT-3'并在此序列上酶切双链DNA，暴露出T位点同时DNA断裂释放的能量储存在其 3'胸腺嘧啶脱氧核苷的磷酸基团和拓扑异构酶I上的酪氨酸残基之间的共价键中。它在识别位点切割DNA一条链，然后使其解链，之后TA配之后酶会重新连接被切割的位点，并将自身从DNA上释放出来。下图为黏性末端和平末端基础机制。
Taq 扩增的DNA的TOPO TA Cloning
利用Zero Blunt TOPO克隆方法克隆平末端DNA。
利用定向TOPO克隆方法克隆平末端DNA。
图片来自于赛默飞官网
2. TOPO工作流程
基本上和TA克隆是相似的，感兴趣的可以看看前面的。这里简略介绍一下，就是目的片段扩增好之后与TOPO质粒载体共孵育5min即可进行下一步的感受态细胞转化。
3. 目的片段的获取
在NCBI上按照上次的方法找到PDCD-1的CDS片段，然后导入到snapgene中，做好自己想要的特征标记。
4. TOPO克隆
1. 将目的片段选择好之后，选择作为PCR模板，用来设计后续的引物；也可以按自己需求直接作为模板。
2. 选择合适满足自己需求TOPO-TA克隆的质粒载体。
3. 选择引物，snapgene会按照Tm设计好扩增引物
4. 点击克隆，名字取好，就可将目的质粒保存好，进行后续的研究。
同理，TOPO平端克隆也是同样的操作。
同理，TOPO定向克隆也是同样的操作。
5. 模拟电泳
模拟电泳是snapgene中非常有趣和实用的一个功能，在这里补充介绍一下。
上图是电泳界面，简单一一介绍一下。
1. 电泳图谱
和实际电泳图跑出来非常相似，可以用来提前预测结果，然后进行结果对照，查看问题点在哪里，下方是泳道信息调整和相对应的工具栏。
2. 泳道调整和酶切位点的选择
进行每一个泳道的调整和选择相应的酶切位点进行电泳。
3. 质粒图谱
质粒图谱和相对应的工具栏，和之前的界面是一样的，都可以进行操作。
泳道1 是线性PCDC1的电泳图
泳道2 是质粒的超螺旋电泳图，能够明显看到质粒是6708bp分子量，但是超螺旋的质粒明显在6kb marker下面，这主要是因为DNA在超螺旋后，改变了自身的拓扑结构，消除了部分溶液中与其作用的氢键，使DNA磷酸骨架中更多的负电荷直接暴露在了电场之中，在电泳的作用下，其可更快速的移动至正极，使得电泳结果看起来分子量要偏小一些。
泳道3 是使用一个酶切线性化后的电泳图，分子量就符合预期。
泳道4 是使用两个酶酶切后的电泳图
泳道5 是使用引物扩增之后得到产物的电泳图，可用来鉴定。
最后一个TOPO克隆设计就完成了，另外还介绍了模拟电泳的使用。这只是前面最基础的设计部分，依靠软件即可完成，后续的鉴定，转化，验证，表达，纯化等等都需要大量的学习才能顺利完成，希望这部分内容能对大家有所帮助。