1905年7月，孙中山抵达日本，提出联合各革命团体的主张，陈天华对此积极响应。8月，中国同盟会成立，陈天华担任秘书，且作为主要起草人之一参与会章的制定。在同盟会的机关报《民报》（民报）上，他发表了多篇文章和具有政治寓意的小说，如《狮子吼》。同年11月，日本文部省出台针对中国留学生的《清国留学生取缔规则》，引发了留日学生强烈抵制，陈天华为鼓舞士气，于12月7日留下万余字的《绝命书》，随后于次日选择投海自尽。他的著作被辑录为《陈天华集》。
陈天华的牺牲在当时引起了广泛的关注和哀悼。1906年春天，陈天华的灵柩运回上海，中国公学为他以及另一位投江自尽的同盟会员姚宏业举办了隆重的公葬会议，到场人数超过千人。会上，人们读诵了姚宏业的遗书和陈天华的绝命辞，悲痛之情溢于言表。会议决定将两人的灵柩送回湖南，举行庄重的公葬仪式，以示对他们的敬意。
陈天华以死明志，他的行动体现了对国家的深深热爱和对救国真理的坚定信念。他曾表示，自己能为国出力的方式无非是写作警醒世人和在必要时刻献出生命。只要能实现救国的目标，他甘愿付出生命的代价。这种以死报国的决心，至今仍令人深深感动。