第1个回答 2022-07-19
细胞毒性T淋巴细胞（CTL）是机体抗肿瘤和抗病毒感染的关键效应细胞，CTL通过T细胞受体（TCR）特异识别靶细胞表面MHC-I 与抗原多肽形成的复合物，进而释放穿孔素、颗粒酶等生物活性物质对靶细胞进行溶解。鉴于CTL在治疗肿瘤和病毒性疾病中的潜在作用，对CTL的基础与应用研究备受关注，大多研究集中于对TCR基因的改造。随着分子生物学的发展，TCR基因克隆、转导技术已较成熟，研究方向主要是如何保证TCR基因高效、正确表达组装成为具生物活性的分子。
机体免疫防御主要由体液免疫与细胞免疫两大系统构成，其中以CD8+T淋巴细胞介导的细胞免疫在抗肿瘤过程中发挥重要作用。CD8+T从静息性T细胞活化为具有特异杀瘤作用的细胞毒性T淋巴 细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL)经过如下3个关键步骤：第一步是抗原加工与提呈，主要由专职抗原提呈细胞树突状细胞（dendritic cell, DC)负责; 第二步是识别与活化，CD8+ T细胞通过其表达的T细胞受体(T cell receptot, TCR)特异识别DC提呈的MHC-Ⅰ-多肽复合物，接受T细胞活化的第一信号，DC表面丰富的免疫共刺激分子给予T细胞活化的第二信号;第三步是识别与杀伤，活化的CTL通过TCR特异识别瘤细胞表面MHC-1-多肽复合物，释放穿孔素和颗粒酶等生物活性物质溶解瘤细胞，或通过Fas-FasL途径诱导瘤细胞凋亡。CTL的TCR对肿瘤抗原的识别是发挥其效应的基础，抗原识别的特异性取决于TCR结构的多肽性。越来越多的研究小组利用现代分子生物学技术克隆能识别特定抗原表位的TCR基因，构建TCR基因病毒载体再转染外周CD8+ T细胞，将之修饰成为能识别特定靶抗原的CTL。体外大规模扩增经TCR基因修饰的CTL，将为肿瘤及传染性疾病提供新型、特异的治疗手段。
TCR是T细胞表面能够特异性识别抗原表位和介导免疫应答的分子，TCR的多态链依编码基因不同命名为α、β、γ、δ链，分别形成αβTCR和γδTCR。 人外周血中约95%为γδTCR，约5%为αβTCR。
TCR分子是由两条糖基肽链通过二硫键组成的异二聚体。所有α、β、γ、δTCR肽链均可分为胞外、 跨膜(TM)和胞质(Cy)3部分。胞外部分又分为可变区（V）、高变区（D）、结合区（J）和恒定区（C）。α链 由V、J、C基因编码，β链由V、D、J、C基因编码。两链不同区域等位基因的重排决定了TCR的多态性，赋予了T细胞识别不同抗原的巨大潜力。TCRα和β肽链可变区存在4个氨基酸高变区（hypervariable region, HVR），亦称互补决定区（complementarity determining region, CDR），其中CDR1、CDR2，CDR3又称为超变区，是抗原特异性结合部位。TCR多态性主要由CDR3决定。
克隆TCR基因的关键是分离到具有高亲和力的识别抗原肽的T细胞克隆。已经有多个课题组利用不同技术从不同来源获得CTL克隆。Morgan等从黑色素瘤患者的肿瘤浸润性淋巴细胞中分离出能识 别MART-1抗原表位的T细胞克隆。Zhang等从慢性丙型肝炎患者外周血中分离得到HCV特异性的CTL克隆。Morgan等运用HLA-A2限制性多肽体外致敏预先免疫该多肽患者的外周血淋巴细胞 （peripheral blood lymphocyte, PBL），然后用有限稀释法获得CTL克隆。Varela-Rohena等运用噬菌体展示技术分离抗原特异性TCR。利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）、反转录PCR （reverse transcription PCR，RT-PCR）技术克隆上述TCRα、β链全长基因。利用基因扫描技术对TCR CDR3区域进行分析，了解其可能存在的亚家族。 Meyerhuber等运用此方法从HER2(369-377)特异性CTL中成功克隆了TCR基因。
目前在TCR基因转染过程中报道较多的是运用逆转录病毒载体。逆转录病毒载体有多方面优势，感染细胞范围广，不仅适用于单层培养的细胞，而且适用于悬浮培养的淋巴细胞;机体对载体产生的免疫反 应较低，在宿主内可以稳定遗传;往往以低拷贝整合，避免了基因重排;经特殊构建的反转录病毒载体是缺陷型的，比较安全;选择不同的外壳蛋白进行包装，可赋予病毒特定的宿主选择性，从而达到靶向导入的目的。
Morgan等从黑色素瘤患者的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）中获得能识别 MART-1抗原表位的CTL克隆，从中克隆到TCR基因，利用逆转录病毒载体将该基因转导入至人外周血 T淋巴细胞，经体外扩增后治疗17例Ⅳ期黑色素瘤患者，15例患者在治疗2个月后循环T细胞数量至少增加了10％，2例患者病情得到控制，在18个月内未复发。Parkhurst等将癌胚抗原（carcino-embry-onic antigen, CEA）特异性TCR构建入逆转录病毒载体转导人外周血淋巴细胞，在TCRα链CDR3区域引入单核苷酸突变，增强了TCR的亲和性。临床试验对3例转移性结直肠癌患者进行治疗，结果所有病例血清CAE水平均有所下降（74％~99％）。
目前较常用的逆转录病毒载体为Moloney小鼠白血病病毒改构的各类逆转录病毒载体，理论上它能转染几乎100％的靶细胞，但实际的转染效率远低于此。近年来人们通过各种改良方法不断提高逆转录 病毒载体转染效率。Yang等运用高速离心法浓缩病毒，4℃，6000rpm，过夜，可使病毒滴度提高50~100倍，进而提高转染效率。研究人员利用逆转录病毒载体将TCRαβ基因转导人初始T细胞,发现在相同的病毒滴度下，以骨髓瘤病毒（myeloproliferative sarcoma virus,MPSV）或鼠干细胞病毒（murine stem cell virus, MSCV）为基础载体比以小鼠白血病病毒（murine leukaemia virus, MLV）为基础的载体有高转染效率和高TCR表达。
改良的逆转录病毒载体已被多个研究组用于不同肿瘤相关抗原特异性TCR基因转移中。但逆转录病毒只能感染分裂期细胞，容纳外源基因的DNA片段长度不超过8000bp，病毒滴度低，有的反转录病毒可能具有激活癌基因的危险。
慢病毒载体其优点在于可有效转染分裂和未分裂细胞;能稳定整合到靶细胞的基因组中;可转移约 8000~10000bp基因片段;能持久稳定表达外源基因，不易导致基因沉默;没有整合位点偏好性。
Yang等将识别MART-1和gp100的TCR基因重组入VSV-G假型第3代慢病毒载体，转染外周T细胞，转染细胞出现了特异性抗瘤活性，包括释放γ干扰素和溶解瘤细胞。2010年该课题组运用CD3抗体和PBL饲养细胞预刺激T细胞，明显提高T细 胞转染效率，12 d内CD8+ T细胞数量扩增达600倍，且具有特异性杀伤活性和记忆性。Stauss等对比逆转录病毒载体与慢病毒载体转移WT-1特异性TCR研究表明，慢病毒载体相对比较安全，可获得较高转染效率。Canderan等设计了杂合非小细胞肺癌特异性TCR，该TCR是由人TCRV区和鼠TCRC区嵌合而成，后将该TCR构建入慢病毒载体转导T 细胞前体，产生特异性CD4＋ CD8＋可稳定表达杂合TCR，T细胞体外增殖良好，并可特异性识别非小细胞肺癌。虽然慢病毒载体有较多优势，但存在有毒力恢复、垂直感染等潜在的安全隐患，仍需要临床更多的深入研究。
将外源基因直接用理化方法转导入靶细胞。常用的转导方法有电穿孔技术、磷酸钙共沉淀法、脂质体介导法、显微注射法等，其对外源基因片段大小无要求，安全性很高，但转染效率很低。
TCR基因转染的载体主要还是病毒载体，但研究人员一直都在尝试寻找更理想载体系统。值得一 提的是，“睡美人”（sleeping beauty, SB）转座子系统已被应用于TCR基因转移过程中，Peng等报道， 该方法TCR转导效率可与病毒载体相媲美，但该系统缺陷在于存在整合位点偏好性，这将是其应用于临床前亟待解决的问题。
研究人员将TCRα和β两条链分别构建入两个独立病毒载体中，因为编码CR单链基因的小病毒载体容易包装，可获得较高的病毒滴度。但为了得到功能性的TCR，含有α和β两条链的两个病毒颗粒必 须同时转染同一个T细胞。这种双感染容易增加插入突变的风险，此外，引入TCR单链易形成内源与外源TCR链的杂合体。Dossett等用不同的启动子来调控TCR两条链的表达，其中TCRα链受控于一 个长末端重复序列（long terminal repeat, LTR）元件，该元件也驱动报告基因neo的表达，TCRβ链的表达由杂合HTLV-I/SV40启动子SRα来驱动。该方法易受启动子的干扰，导致TCR表达下调。Wang等将HC/2G-1 TCR两条链由一个内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES）原件连接，在一般启动子启动下作为一个单一转录盒来表达。IRES原件可以保证TCR两条链同时表达，但IRES5′端基因通常较3′端基因表达量高，会导致突变的发生。 Chinnasamy等将TCR基因两条链通过一个源自 微小RNA病毒的肽原件2A（2A peptide, p2A）来进行连接。这种连接方式可以产生一条单一的编码TCRα和β链的mRNA。翻译时，核糖体可跳过2A肽序列，从而产生两条单独的肽链：TCRα-2A融合蛋白和甘氨酸TCRβ，这种连接方式可以等量表达TCRα和β链，此外肽序列要比IRES原件短，构建的病毒载体较小，容易包装，可获得较高病毒滴度。
TCR组装和表达是一个复杂的过程，在细胞表面进行表达之前，TCRα链和β链首先形成异源二聚体，然后与CD3复合物在内质网结合，最终TCR CD3复合物由内质网释放后转移至细胞膜，在这个过程中会有诸多因素影响TCR的表达效率。
密码子优化是指用人类基因组中常见的同义密码子置换非常见密码子。已有证据表明，密码子优化的TCR基因在转导T细胞中表达水平比野生型TCR基因有所提高，从而增强其体内功能。但是，密码子优化可能产生免疫源性TCR，此过程也可能会伴随多肽序列的改变产生另一种开放读码框，有一定风险。
TCR基因转移载体构建时最好使用单病毒载体，可以同时编码TCRα链和β链，这样可以防止插入突变和转导T细胞仅表达引入的1条链，可以减少引入链与相应内源性TCR链误配的风险。如果存在TCR其中1条链供应不足的情况，会削弱TCR异源二聚体的聚合细胞表面表达。近年来，研究人员运用IRES序列或者P2A，连接TCRα链和β链构建载体，很大程度上克服了载体配置造成的两条链表达不均衡的问题。
有效的细胞表面TCR表达需要稳定的TCR CD3复合体构建。没有CD3的情况下，TCR不能聚合而被降解。因此向T细胞内引入外源性TCR时，CD3分子的存在是主要限速步骤。竞争可降低引入性TCR细胞表面表达。 引入性TCR的表达水平通常比内源性TCR低，内源性TCR可以削弱转导T细胞对低浓度TCR识别抗原的反应活性，这一结果验证了引进TCR与内源性TCR竞争有限的CD3分子。 Sachiko等通过小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）的表达使内源性TCR沉默以提高外源性TCR基因的表达和活性。最近研究表明，带有编码TCR α和β链基因载体与另一个编码CD3γ、δ、ε、ζ基因的载体进行双重转导CD8+T细胞，可以提高CD8+T细胞活性。
有研究表明单独α或β链转导T淋巴细胞可导致外源性TCR链和内源性TCR链混合二聚体的形成。外源性TCRα或β链与内源性TCRα或β链的误配导致目标TCR自身配对减少，从而影响TCR的亲和性。此外，误配二聚体的形成可能会导致自身免疫反应等安全问题。Thomas等将TCR恒定区鼠源化，或进行半胱氨酸修饰产生分子间二硫键，发现均可提高外源性TCRα和β链的正确配对。 Voss等在TCRα和β链恒定区插入一对相互作用氨基酸，改变TCR恒定区二级结构（从“knob-into-hole”构象变为“hole-into-knob”）来提高两条链的正确配对。
尽管目前TCR基因修饰CTL的基础与临床研究均取得较好进展，但仍存在一些问题，如功能性TCR的正确表达、TCR表达效率、TCR基因修饰CTL的亲和力与体内有效性和存活时间、临床安全性等均需要深入研究。