第1个回答 2012-05-11
一些RNA提取方法，在进行具体实验时，应根据研究对象的性质，提取核酸的用途而对上述方法在操作步骤和试剂使用量上作一定的修改。
1、 在核酸提取时，为了增加细胞的裂解度，增加核蛋白复合体破碎度，以释放更多的游离核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在确保没有核酸水解酶存在的前提下，酶反应时间越长越好。
2、 有时在使用蛋白酶时，为了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶缓冲液中用终浓度5mM的EDTA代替NaCL，并且可将反应温度提高到50－60℃，并将反应时间缩短到15－25min，但酶用量必须提高10－20倍。溶菌酶使用时缓冲液中需加EDTA，因游离金属离子对酶有抑制。
3、 许多植物材料中富含酚，在细胞破碎时，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的锟类物资，影响核酸的提取及降低提取质量，在提取液中加入PVP和巯基乙醇对降低酚类的干挠可能有所帮助。PVP将与酚形成复杂的聚合体，在提取时将酚从核酸成分中游离。且PVP与巯基乙醇作为强还原剂可防止多酚的褐变。另外作为还原剂的这些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。
4、 许多生物材料在提取核酸时，都会遇到多糖的污染问题，具体表现为有机溶剂沉淀时，沉淀很多，但复溶时，大量沉淀不溶，电泳观察时核酸含量很低。
克服多糖污染可采用以下一些办法
1) CTAB多次抽提。
2) 在有机溶剂沉淀时先稀释样品浓度（可到10倍左右），对低浓度样品再进行沉淀。
3) 在有机溶剂沉淀时选用异丙醇和5MNaCL作为沉淀溶剂，此时氯化钠的用量可用到1/5-1/2的体积，异丙醇可用到0.6-1的体积。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。
5、 在核酸提取时，酚与氯仿均起到变性的作用。酚的变性能力强于氯仿，但酚与水有一定的互溶，因此酚抽后，除可能损失部分核酸外，水相中还会残留酚，而酚的存在将对核酸的酶反应产生强的抑制，因此在操作中可单用氯仿作变性剂、也可用酚/氯仿混合变性，也可用单一酚作变性己，但用单一酚后在有机溶剂沉淀时一定要用氯仿从抽提。
6、 在操作中当加入变性剂氯仿后，为了保证核酸样品的完整性，操作要轻，尤其在提DNA时，更要避免剧烈操作。
7、 在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。
8、 在提取核酸时，如样品浓度低，则应增加有机溶剂沉淀时间，－70℃下>30min;－20℃过夜将有助于增加核酸的沉淀量。
9、 在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水因此时离子浓度可能较高，而到高度纯化后低温保存时最好复溶于TE缓冲液中，因溶于TE的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸样品保存时要求以高浓度保存，低浓度的核酸样品要比高浓度的更易降解。
10、 核酸提取后可通过PCR 、RT－PCR直接扩增出目的基因片断，也可首先构建文库、然后由RACE、dd-PCR等差异显示技术、AFLP等标记技术、差异杂交或文库扣除技术等方法筛选出特异探针，再用此探针从文库中筛选出完整基因。
11、 在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以增加抽提次数.提取RNA请尽量在低温下操作，如果条件不容许，在室温下操作的时间要尽可能的短。
RNase污染的10大来源
1：手指头–手指头是外源酶的第一来源，所以必需戴手套并且频繁更换。另外，口罩也必需戴，因为呼吸也是一个重要的酶来源。戴手套口罩的另外的好处是保护实验人员。
2：枪头，离心管，移液器–单纯的灭菌是不能灭活Rnase的，所以枪头和离心管要用DEPC处理，即使是标明为DEPC处理过的。移液器最好是专用的，用前用75%的酒精棉球搽拭干净，尤其是杆子；另外，一定不要使用褪头器。
3：水/缓冲液–一定要确保无Rnase污染。
4：实验台面–最起码要用75%的酒精棉球搽拭干净。
5：内源Rnase–所有组织均含内源酶，故组织用液氮速冻是降低降解的最好办法。液氮保存/碾磨方法的确不方便，但对有一些内源酶含量很高的组织，却是唯一的办法。
6：RNA样品–RNA抽提产物可能都会含痕量的Rnase污染。
7：质粒抽提–质粒抽提往往用到Rnase降解RNA，残留的Rnase要用ProteinaseK消化，PCI抽提。
8：RNA保存–即使低温保存，痕量的Rnase亦会导致RNA降解。长期保存RNA的最好办法是盐/醇悬液，因为醇在低温时抑制所有的酶活性。
9：阳离子(Ca,Mg)–在含这些离子时，80C加热5分钟会导致RNA被剪切，故如果RNA需要被加热，保存液需要含螯合剂(1mM Sodium Citrate,pH6.4)。
10：后续实验所用的酶–酶均有可能被Rnase污染。
RNase和DEPC处理
1：高压灭菌是可以灭活部分RnaseA的。实验证明：37C与RNA反应，没有灭菌的PBS，活性点为100pg/ml；灭菌后，活性点为100ng/ml。当然，灭菌后Rnase仍然不能认为没有残留。
2：DEPC在水中半衰期为30分钟。0.1%的DEPC灭菌15分钟可以认为彻底破坏了DEPC。破坏后可以闻到一点气味。
3：在1M Tris,1M HEPES,1M MOPS中分别加入1ug/ml RnaseA和0.1%及1%DEPC实验。结果提示，0.1%DEPC只对MOPS有效，而1%DEPC对三种试剂都有效。
4：0.01%DEPC，0.1%DEPC，1%DEPC有效去除RnaseA的浓度分别为：100ng/ml，500ng/ml，1ug/ml。但要注意，DEPC灭活后的副产品，对有些后续实验是有影响的。
RNA抽提的10大窍门
1：快速阻止Rnase活性–样品收集后快速冷冻，裂解时快速操作灭活Rnase。
2：选择合适的抽提方法–高核酶含量的组织，脂肪组织最好用含苯酚的方法。
3：预判质量要求–Northern，cDNA文库构建对完整性要求高，RT-PCR, RPA(Ribonucleaseprotectionassay)对完整性要求不是很高。RT-PCR对纯度(酶抑制物残留)要求很高。
4：彻底匀浆是提高得率和降低降解的关键。
5：检查RNA的完整性–电泳检测，28S:18S=2:1是完整的标志，1:1对大部分实验也是可以接受的。
6：去除DNA–用于RT-PCR,array analysis最好用Dnase I去除DNA。
7：降低外源酶的污染–不能从外面又导入酶。
8：低浓度的核酸浓缩时，要加入助沉淀试剂。但要防止助沉淀剂含酶及DNA污染。
9：彻底溶解RNA，必要时可以65C加热5分钟。
10：合适的保存方法–短时间可以–20C保存，长期请保存于–80C。
提高RNA得率
首先要意识到不同得样品其RNA含量差别很大。高丰度(2-4ug/mg)的如肝脏，胰腺，心脏，中丰度(0.05-2ug/mg)的如脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢，低丰度(<0.05ug/mg)的如膀胱，骨，脂肪。
1：裂解细胞使RNA释放出来–RNA如果不被释放出来，得率是会降低的。电动匀浆比其它匀浆方法效果更好，但也可能需要结合其它得方法，如液氮捣碎，酶消化(Lysozyme/Lyticase)
2：抽提方法的优化。基于苯酚的方法的最大问题是分层不彻底和部分RNA的丢失(不能全部将上清取出)。分层不彻底是因为核酸和蛋白质含量高，可以用增加裂解液使用量或者降低样品量解决。脂肪组织要增加一步氯仿抽提。RNA的丢失可以用反抽方法或者去除有机层后再离心的方法降低。基于柱离心式方法的最大问题是样品过量。
经典抽提小技巧
1：Phenol纯化：将等体积的1:1 Phenol/Chloroform加入，剧烈混允1-2分钟。高速离心2分钟。小心取上清(80-90%)。决不能取到中间层。可以使用等体积的反应液加入Phenol/Chloroform中，同样再取出上清。将两次的上清混在一起用于核酸沉淀，可以提高得率。混允时不能太温和，也不要试图取出全部上清。
2：70-80%乙醇洗涤：洗涤时，一定要将核酸悬浮起来，才能保证残留的盐被洗去。同时，在倒掉乙醇后，立即高速离心数秒，再用移液器去除残留的乙醇。室温静置5-10分钟后，溶解。
特殊组织的抽提
纤维组织：心脏/骨骼肌等纤维组织抽提RNA关键在彻底破碎组织。这些组织细胞密度低，故单位重量的组织RNA的含量就少，最好用尽可能多的起始量。一定要在冷冻条件下将组织彻底磨碎。
蛋白/脂肪含量高的组织：脑/植物脂肪含量高，PCI抽提后，上清含白色絮状物。必须用氯仿再次对上清进行抽提。
核酸/核酶含量高的组织：脾/胸腺等核酸和核酶含量很高。在冷冻条件下碾磨组织，再快速匀浆，能有效灭活核酶。但如果裂解液太粘稠(因为核酸含量高的缘故)，PCI抽提不能有效分层；加入更多裂解液可以解决此问题。多次PCI抽提可以去除更多残留的DNA。如果加入醇后马上有白色沉淀形成提示有DNA污染。溶解后用酸性PCI再次抽提，可以去除DNA污染。
植物组织：植物组织比动物组织更为复杂。一般，大家都是在液氮条件下对植物进行碾磨的，所以内源酶作用使RNA降解的现象不常见。如果降解问题不能解决，几乎可以肯定是样品中的内含杂质导致。许多植物的内含杂质都会导致残留，之所以残留，往往是因为这些杂质与RNA有一些相似性：你沉淀我沉淀，你吸附我吸附。这些特点决定了它们是非常强的酶抑制剂。目前，商品化的RNA抽提试剂经过小量调整，可以适合几乎所有的动物组织，但却没有一种商品化的RNA抽提试剂，可以适合大部分植物组织。
样品冻融的影响
冷冻的样品可能较大，用于抽提RNA之前，需要切割。切割过程中样品往往出现融化(可能是部分融化)。冷冻的样品抽提RNA前可能还要称重，这个过程肯定会出现融化。有时候，液氮碾磨过程中也会出现样品的融化；或者冷冻样品不经过液氮碾磨直接加入裂解液中，在彻底匀浆前肯定会出现融化。实验表明，冷冻组织在融化过程中比新鲜组织更容易发生RNA的降解。可能的原因是：冻融过程破坏了细胞内的结构，使内源酶更容易与RNA直接接触。
RNA质量的判断
通常，使用电泳判断RNA的完整性，使用A260/A280判断RNA的纯度。理论上，完整的RNA拥有28S:18S=2.7:1的比例，大部分资料则强调28S:18S=2:1的比例。事实是，除了细胞外，从其它样品中抽提的RNA几乎都得不到2:1的比例(此结论使用AgilentBioanalyzer获得)。RNA的电泳结果受许多因素的影响，包括二级结构，电泳条件，上样量，被EB饱和的程度等。使用非变性电泳检测RNA，以DNAMarker做对照，如果2kb处的28S和0.9kb处的18S条带清晰，且28S:18S>1，该完整性可以满足绝大部分后续实验要求了。
A260/A280是一个给大家带来许多困惑的指标。首先要明确该指标用于核酸的原始含义是：纯的RNA，其A260/280=2.0左右。纯RNA是‘因’，A260/A280=2是‘果’。现在大家却在拿A260/A280当‘因’用，认为“如果A260/A280=2，所以RNA是纯的”，自然会产生困惑。有兴趣的话，可以在您的RNA样品中加入一点抽提中经常使用的试剂，如苯酚，异硫氰酸胍，PEG等，再测A260/A280比值。现实是，许多抽提RNA时使用的试剂，以及样品中的许多杂质都在A260和A280处附近有吸收，对A260/A280产生影响。目前最具有指导性的做法是：对RNA样品在200-300nm范围扫描。纯RNA的曲线具有如下特点：曲线平滑，A230和A260是两个拐点，A300接近0，A260/A280=2.0左右，A260/A230=2.0左右。如果没有扫描数据，也一定要测定A260/A230比值，因为该比值对所有影响酶反应的杂质的残留更敏感。要考虑设备的线形范围(A260要处于0.1–0.5之间)。另外有两个有用的现象：在水中测定A260/A280，比值将变低0.3左右；而在10mM EDTA中测定的比值比在1mM EDTA中测定的高0.2左右。
RNAguard：抑制组织/细胞内源酶的试剂
综上所述，确保RNA不降解的传统做法是：在取组织前将含液氮的容器放在手边，一旦取出所需组织，立即切割小后投入液氮中。抽提前先在碾钵中加入适量的液氮，再将组织从液氮中取出迅速放入已加入液氮的碾钵中碾磨。碾磨过程中要及时补充液氮以防止组织融化。待组织彻底碾磨碎后，等待剩余液氮恰好挥发完时，立即将碾磨碎的组织移入裂解液中快速匀浆......安全的称重几乎不可能。这么严格的操作，是没有多少实验人员去认真执行的。