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PCR扩增鉴定阳性克隆结果
求助通用引物验证
阳性克隆
答:
PCR
(聚合酶链式反应)是一种分子生物学技术,通过DNA复制在体外
扩增
特定的DNA片段。在验证
阳性克隆
时,通用引物被设计用来与克隆载体上的通用序列结合,从而扩增出插入片段。这种方法可以快速、准确地
鉴定
出含有目的基因的阳性克隆。通用引物的设计原则是基于载体上的通用序列,这些序列通常是载体构建时加入的...
为什么
阳性克隆pcr鉴定
会有个泳道里没有条带
答:
可能原因:1.PCR扩增的是假克隆,因为PCR验证的可靠性不稳定
。2.质粒中酶切位点变异你可以做如下实验:1.看重组质粒的大小是不是比原始质粒大2.用提出的质粒做pcr,这样比较可靠,用细菌做pcr的假阳性极高3.用别的酶再试一下,是否能切出目的片段。祝实验成功 ...
基因克隆有哪些步骤,如何筛选
阳性克隆
答:
PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPO TA的方法插入到载体质粒
。转染大肠杆菌 筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法,就是在载体上,序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列,如果不被破坏,产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物,形成蓝色产物。如果有目的序列插入,这个酶就不能表达,形成的克隆...
如何理解
pcr扩增
的原理和过程
答:
每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。如图所示:现在有些
PCR
因为
扩增
区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度。
质粒转化后得到的
阳性克隆
有哪些方法可以
鉴定
?并说明鉴定的依据。
答:
1
菌落PCR。设计引物扩增质粒特有的目的片段,如果阳性克隆里面有改片段,则说明转化成功
。2 快抽质粒。将阳性菌落划平板,几个小时后,富集菌,然后快速抽提。看质粒大小有没有插入目的片段。3 提质粒,酶切鉴定。4 提质粒测序。1,2 都是早期的快速鉴定,假阳性高;3,4慢,但是比较确信。一般组合来...
rt-
pcr
产物做测序
结果
有双峰,这个结果就完全不能用了吗?
答:
因此就彻底没有什么用了,重新开始吧。如果你是想克隆一个基因或者一个基因片段,那么没有关系,把RT-
PCR扩增
的片断纯化后装到任何一个载体里面,转化大肠杆菌,获得
阳性克隆
。按照概率,其中一部分应该是你需要的目的基因,酶切后进行测序
鉴定
,找出你需要的克隆就可以了。
菌落
pcr阳性
单
克隆
为什么有没连上的
答:
1、连进去的可能不是你的目标片段,也即酶切产物或者PCR产物本身就有问题了;2、污染,也就是挑的菌落不纯;3、在转化的时候有很多的片段其实并未有转入到细胞中,而是在平板上,在做菌落
PCR的
时候P出的是它们的产物;4、基因组的影响 其他原因也挺多的 ...
PCR扩增
后的目的基因如何提取分离? 对
阳性克隆
中的目的基因又如何提取...
答:
PCR扩增
的目的基因可以跑电泳后,把目的DNA带纹切下来,回收就可以了;
阳性克隆
的目的基因,可以先对这个克隆液体培养后提取质粒(如果是重组在质粒载体上的)或染色体(如果是YAC之类的),酶切后电泳,回收。这个有专门的回收试剂盒,很方便的。
什么叫
阳性克隆
筛选法? 请打击帮帮忙!!
答:
导入了报告基因的大肠杆菌在含抑制性物质的培养基上就可以生长,而不含报告基因的大肠杆菌(就是转化失败的)就不能生长。这样过了两三天后,在培养基上看见的菌落就是
阳性
科隆。这一过程就是阳性科隆筛选。一般选用的报告基因像青霉素抗性基因,链霉素抗性基因等等。如果还想了解得更详细,就去买本分子...
细菌
pcr鉴定
的
结果
存在一定的假
阳性
,如何进一步确认其阳性
答:
将
PCR
确定
阳性
挑选出几个
克隆
,培养后进行提质粒,酶切,电泳
鉴定
是否有目标片段插入,可以避免假阳性。另外,最保险的办法就是,酶切确认过的克隆,再送去测个序,保证目标片段的序列是完全正确的。当然,也可以直接取几个单克隆去测序,看哪一个是阳性。
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