western blot的原理

Question

蛋白印迹的实验原理是什么呀 有详细的讲解吗

Answer 1

其实原理很简单，你要坚持某种蛋白在样品中是否含有或者大致的量，你就可以先购买或制备该蛋白的抗体，之后通过电泳实验，将蛋白样品简单分离，可以是按分子量分离也可以是按等电点分离，或者进行双向电泳，一般使用SDS-PAGE。之后进行转膜，将蛋白从胶上转移到膜上，以利于抗体杂交，之后加入抗体进行孵育杂交，之后洗掉没有结合的抗体，就可以进行显色反应了，显色反应很多，有化学发光、荧光等等。其实说白了就是让你能检测到你加入的抗体都在哪里。之后你就可以确认你的样品里有没有该蛋白，相对的量是多少。要是想要确定绝对的量就要使用ELISA 了。

Answer 2

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达