第1个回答 2021-02-24
需要做核算检查报告
HIV核酸检测
HIV核酸检测,可直接检查HIV RNA,可在发现血清学变化之前检测HIV感染,而且比P24抗原检测方法更灵敏。
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核酸检测
随着生物技术的发展,核酸检测得到了人们越来越多的重视,它可直接检查HIV RNA,可在发现血清学变化之前检测HIV感染,而且比P24抗原检测方法更灵敏。简单的说就是病毒感染人体后,一般情况下可通过一系列检测被发现,而最早能被检测到的是病毒核酸。现有的酶联免疫等血清学检测方法检测的是抗原或抗体,而核酸检测技术检测的是病毒核酸,所以能更早地发现病毒感染。正常42天左右血液才能检测到HIV病毒,HIV核酸检测将艾滋病病毒的检测“窗口期缩短至11天。
并且核酸检测这项技术可将乙肝、丙肝病毒的检测“窗口期”分别由原来的50天、72天缩短到25天、59天。血液安全由此可得到更好保障。
方法及程序
HIV核酸定性检测
1.1 方法和试剂
1.1.1 方法
(1)检测方法为商品化试剂盒和实验室自建方法,商品化试剂应严格按说明书操作。下面介绍的方法是实验室自建方法,供参考。
(2)检测血浆或血清样品使用逆转录PCR(RT-PCR)方法,建议第一轮PCR扩增使用RT-PCR一步法;检测血细胞或组织样品使用PCR方法。一般使用扩增两轮的套式PCR方法。
(3)设立阳性、阴性及空白对照。阳性对照为与待测样品同质、含有目的基因的样品;阴性对照为与待测样品同质、不含有目的基因的样品。阳性和阴性对照样品应与待检样品处理程序一致。阴性对照的设置数量应根据实验样品的数量设置在不同的位置。
1.1.2 试剂
(1)PCR引物:一般使用扩增HIVgag和/或pol和/或env和/或LTR等引物。进行RNA逆转录时可使用下游特异性引物或随机引物。引物设计可参考文献或自行设计,应尽量涵盖常见的HIV流行毒株,也可使用兼并性引物。
(2)主要试剂:包括核酸提取纯化、逆转录、PCR所需的试剂。使用商品化核酸提取纯化试剂、逆转录酶反应试剂和PCR扩增试剂。
(3)抗污染试剂:实验室自建检测方法可使用抗污染试剂,参考尿嘧啶DNA糖基化酶抗污染方法。
1.2 扩增目的基因片段
1.2.1 样品的采集和处理
1.2.2 核酸提取
可使用硅胶柱离心、磁性硅胶颗粒分离方法以及自动化仪器等商品化试剂或设备并按说明书操作。提取RNA时应注意防止RNA降解。DNA应置于-20℃保存,RNA和需长期保存的DNA应置于-80℃保存。
1.2.3 逆转录合成cDNA
使用商品化试剂并按说明书操作。逆转录cDNA合成反应需使用逆转录引物、dNTPs、逆转录酶、RNA酶抑制剂、DTT、缓冲液和适量无RNA/DNA酶的超纯水以及RNA模板。在扩增仪或水浴箱中,在规定的温度和时间下进行逆转录反应。建议使用商品化RT-PCR一步法试剂进行第一轮扩增反应。
1.2.4 PCR扩增反应
使用商品化试剂按说明书操作。PCR反应需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶(如Taq酶等)、缓冲液、和适量无RNA/DNA酶超纯