PCR产ç©ç´æ¥æµåºææ¯ç°å·²æ为ååçç©å¦ååºå ç»å¦ç 究ä¸çä¸ä¸ªéè¦ææ¯,广æ³ç¨äºåºå çªåæ£æµãéä¼ æ§ç¾ç
è¯æãåæ ¸è·é
¸å¤ææ§ç 究ãåºå ç»éå åºå群ç.ä¸ä¼ ç»å
éæµåºææ¯ç¸æ¯è¾,ç´æ¥å¯¹PCRæ©å¢çDNAè¿è¡æµåº,çå»äºèæ¶çå
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»,模æ¿æåçéå¤æ§æä½,å¯ä»¥ä»å°éçåå§æ ·åä¸å¾å°æ£ç¡®çDNAåºåä¿¡æ¯.PCR产ç©ç´æ¥æµåºææ¯å
·æå¿«éãç®ä¾¿ã稳å®ç»æµçä¼ç¹. è¯éªè¯å PCRæ©å¢çåé¾DNA模æ¿é¿çº¦20ä¸ªæ ¸è·é
¸çDNAå¼ç© DNAèåé
¶æµåºè¶ 0.1mol/L DDT α-32P-dATP dNTP/ddNTPæ··åç©(80μmol/L/8μmol/L) dNTP(dCTPãdGTP ãdTTP å0.75μmol/L) æµåºååºç¼å²æ¶²ï¼40mmol/L Tris-HCl(pH7.5),20mmol/L MgCl2,50mmol/L NaCl ç»æ¢ç¼å²æ¶²ï¼95% ç²é
°èº,20mmol/L EDTA,0.05% 溴é
è,0.05% äºç²è¯è
è¯éªæ¥éª¤ï¼ 1ã 4个微é离å¿ç®¡ä¸åå å
¥dNTP/ddNTPæ··åç©2.5μl,æ··åç©37OC温浴5min,å¤ç¨. 2ã å¨ä¸ä¸ªç©ºçå¾®é离å¿ç®¡ä¸å å
¥1pmolçPCRæ©å¢åé¾DNA,10pmolæµåºå¼ç©,2μl 5Ãæµåºç¼å²æ¶²,å åè¸æ°´è³æ»ä½ç§¯10μl,96OCå ç8min,å°æµ´æ³ å´1min,4OC 10000g离å¿10s. 3ã å å
¥2μlé¢å·çæ è®°æ··åç©(dCTPãdGTP ãdTTP å0.75μmol/L),α-32P-dATP 5μCi,1μl 0.1mol/L DDT,æµåºé
¶2U,å æ°´è³15μl,æ··ååç½®å°ä¸2min,æ è®°æ°åæçDNAé¾. 4ã å¨ç¬¬1æ¥éª¤ç4个管ä¸åå å
¥3.5μlæ è®°ååºæ··åç©,37OC温浴5min.æ¯ç®¡åå å
¥4μlç»æ¢æ¶². 5ã æ ·åå¨80OCçæ°´æµ´ä¸çåæ§5min,æ¯ä¸æ³³éå 2μl å å°æµåºè¶ä¸,çµæ³³å离è¿äºç段. 注æäºé¡¹ï¼ 1.?PCR产ç©è¦æä¸å®çé¿åº¦(>200bp),å 为æµåºç»æ两端20-30bpççµæ³³å³°å¾çåç¡®æ§è¾ä½. 2.?纯åPCR产ç©å¯éè¿ç¦»å交æ¢å±æ使æ©å¢çDNA段ä¸ååºå©ä½çdNTPåå¼ç©å离ï¼ä¹å¯éè¿ç¼èç³åè¶çµæ³³,å°PCR产ç©ä¸éç¹å¼æ§æ©å¢äº§ç©åå¼ç©å离å¼æ¥ï¼å¦ææ©å¢çç¹å¼æ§è¾é«æ¶,å¯ç´æ¥éè¿é
ï¼æ°¯ä»¿æ½æ,ä¹éæ²æ·çæ¹æ³æ¥çº¯å. 3.?æµåºå¼ç©è®¾è®¡åå类似äºPCRå¼ç©è®¾è®¡,å¯å¨DNAåæ仪ä¸åæ20个左å³çæ ¸è·é
¸ä½ä¸ºå¼ç©,ç»è¿é«å液ç¸å±ææèä¸ç¯é
°èºåè¶çµæ³³çº¯åå,å³å¯ç¨ä½æµåºå¼ç©. PCR循ç¯æµåºæ³ PCR循ç¯æµåºæ³æ¯å°PCRæ©å¢åæ ¸é
¸åºååæææ¯ç¸ç»å,ä»èå½¢æçä¸ç§æµå®æ ¸è·é
¸åºåçç 究æ¹æ³,ä¹ç§°ä½çº¿æ§æ©å¢æµåº.该æ¹æ³éç¨PCR仪å ç使DNA模æ¿åæ§,å¨TaqDNAèåé
¶ä½ç¨ä¸,以温度循ç¯æ¨¡å¼å¨æ¨¡æ¿ä¸è¿è¡å¤è½®çåè±æ°§æ ¸è·é
¸æµåºååº,线æ§æ©å¢æ è®°çDNAåå. PCR循ç¯æµåºæ³ä¸ä»¥å¾çæµåºæ¹æ³ç¸æ¯,å
¶ä¼ç¹å¨äºï¼å¤§å¤§åå°æéç模æ¿éï¼è½æé«æµåºååºäº§ççä¿¡å·,éä½äºæä½çå¤ææ§,ä¸èåé
¶çç¨éåå°ï¼å¯å¨å°éå¶å¤ç模æ¿ä¸è¿è¡çéååºï¼é«æ¸©ä¸è¿è¡çæµåºååºä½¿DNAèåé
¶å¬åçèåååºè½å¤éè¿æ¨¡æ¿äºçº§ç»æçåºåï¼åé¾éç¯DNAå¯ä»¥ç´æ¥ä½ä¸ºååºæ¨¡æ¿åºç¨,ä¸ç¨ä½é¢å
碱åæ§å¤ç.ç±äºPCR循ç¯æµåºæ³è½å¤ç®åãå¿«éå°æ£æµç¹å®åºå,å æ¤, PCR循ç¯æµåºæ³å¨æ ¸é
¸åºååæç 究ä¸åå°å¹¿æ³çéè§. è¯éªè¯åï¼ DNAæµåºè¯åç dNTP ddNTP ä¸ç¯é
°èºåä¸ç¯é
°èºå°¿ç´ TEMED(N,N,Nâ,Nâ-åç²åºä¹äºèº) è¿ç¡«é
¸éµ 6%æµåºè¶ï¼6%ä¸ç¯é
°èº,7mmol/L å°¿ç´ ,1ÃTBE. 10Ãæµåºç¼å²æ¶²ï¼100mmol/L Tris-HCl(pH8.8),500mmol/L KCl,40mmol/L MgCl2,0.01%æè¶,20μmol/L dATP,50μmol/L dCTP,50μmol/L dGTP,50μmol/L dTTP ç»æ¢æ··å液ï¼ddATP (600μmol/L),ddCTP (600μmol/L),ddGTP (100μmol/L),ddTTP(1000μmol/L) ç»æ¢ç¼å²æ¶²ï¼95%ç²é
°èº,20mmol/L EDTA,0.05%溴é
è,0.05%äºç²è¯è
è¯éªæ¥éª¤ 1ã 4个å°ç¦»å¿ç®¡,æ¯ä¸ªå°ç®¡å å
¥3μlçç»æ¢æ··å液,å°ç®¡åæ¾å¨å°ä¸. 2ã å¨DNA模æ¿ä¸å å
¥å¼ç©(4pmol), 4μl 10Ãæµåºç¼å²æ¶², 10μlα-32P-dATP, 2U TaqDNAèåé
¶,å åè¸æ°´å°30μlå½»åºæ··å,æ¯ç®¡7μlå å
¥ä¸é¢4个å°ç®¡ä¸. 3ã ååºæ¶²ä¸å 30μlçç³è¡æ²¹. 4ã 95OC 30S,50OC 30S,72OC 60Så
±30个循ç¯,å¯æ ¹æ®å
·ä½çæ
åµè¿è¡éå½çè°æ´å¾ªç¯æ¡ä»¶å循ç¯æ¬¡æ°. 5ã ååºç»æåå¨æ²¹å±ä¸å å
¥5μlçç»æ¢ç¼å²æ¶²å¹¶ç¨å æ ·æªæ··å. 6ã ä¸æ ·åå°æ ·åå¨å¤§äº80OCçæ°´æµ´ä¸çåæ§5min,æ¯ä¸éå 2μlå å°æµåºè¶ä¸,çµæ³³å离è¿äºç段. 注æäºé¡¹ï¼ 1ã å¶å¤æµåºæ¨¡æ¿ï¼PCR æ©å¢ç产ç©å¯ä»¥ç»è¿ä½çç¹çç¼èç³åè¶çµæ³³çº¯ååæ¶å,ç¨äºåºååæï¼å¯ç»è¿æ±å±æ纯å,å»é¤PCR ååºåå©ä½çdNTPåå¼ç©å,ç¨äºåºååæ.PCR 产ç©ä¹å¯ä¸ç»çº¯åç´æ¥ç¨äºæµåº,ä½æ¯è¿ç§æµåºäº§ççç»æè¾å·®,建议æµåºä¹ååºè¿è¡PCR产ç©ç纯å.åç§æ åçè´¨ç²å¶å¤æ¹æ³æ纯ååºçè´¨ç²åå¯ä½ä¸ºæµåºæ¨¡æ¿ä½¿ç¨.ç¨æ åæ¹æ³å¶å¤çM13å¬èä½ãç²ç²ãλDNAé½éåç¨ä½æµåºæ¨¡æ¿ç¨.ä½è¦æ³¨æçæ¯ååºä½ç³»ä¸ä¸åºæä¸å¼ç©äºè¡¥çéç®çåºå åºå,å¦åå°ä¼å¯¼è´æµåºå®éªç失败. 2ã æµåºå¼ç©ï¼æµåºå¼ç©æ¯æåæçä¸æµåºæ¨¡æ¿é¾ç¹å¼æ§äºè¡¥çå¯¡æ ¸è·é
¸åºå.å¯ç¨Î±-32P-dATPåT4å¤èæ ¸è·é
¸æ¿é
¶å¯¹å¼ç©ç5â端è¿è¡æ è®°,ååºä½ç³»ä¸å¼ç©ãæ¿é
¶åα-32P-dATPè¦ä¿æå¨æä½³çæ¯ä¾,以å¾å°é«æ¯æ´»æ§çæ è®°å¼ç©ï¼ä¹å¯ç¨Î±-32P-dATPæ è®°æ°åæçDNAé¾.å¼ç©çæµåº¦ä¸å®é«,å¦å容æå½¢æå¼ç©äºèä½,æ产çéç¹å¼æ§çæ©å¢å¼ç©. 3ã é
¶ï¼åç§ç¼ºä¹3ââ5â端å¤åæ´»æ§çèçDNAèåé
¶é½å¯ä»¥ç¨äºå¾ªç¯æµåº,å
¶ä¸TaqDNAèåé
¶å¨DNAæµåºä¸æ为常ç¨.è½ç¶åºç¨PCR循ç¯æµåºæ³è½å¤ç®åãå¿«éçè¿è¡åºå åºåçæµå®,ä½ä»æªè½éåºå¤§è§æ¨¡DNAåºåæµå®çéè¦,èPCR循ç¯æµåºæ³ãè§å
æ è®°åèªå¨æµåºä»ªçèå使ç¨æ为大è§æ¨¡åºå ç»æµåºç主è¦ææ¯.该ææ¯æ¯éç¨è§å
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