食品微生物学检验 大肠菌群计数:大肠菌群平板计数法(GB 4789.3-2010)
一 试剂和仪器
煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB肉汤)
结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)
恒温培养箱
自动稀释仪
均质器
振荡器
二 样品处理
固体样品应在无菌条件下充分粉碎。本次演示以乳粉为例,取密封状态良好的试样,备用待测。
三 检测过程
实验前准备
进入无菌操作室前应更换无菌实验服,戴帽子、口罩、无菌手套。进入无菌操作室后,首先用镊子夹取适量酒精棉全面擦拭双手,然后才能进行实验操作。
酒精易燃,因此在擦拭双手的过程中应离开酒精灯火焰一定距离,防止出现危险,待手上的酒精挥发完全后,再进行实验操作。
样品的稀释
取一洁净无菌均质袋于自动稀释仪上,用酒精棉充分擦拭样品袋,将剪刀置于酒精灯外焰上充分灼烧,小心剪开样品袋。将称样勺于酒精灯外焰灼烧片刻,准确称取25g样品于无菌均质袋中。用酒精灯外焰灼烧注水口片刻,在盛有样品的均质袋中注入225mL无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液。取下均质袋,将均质袋放入拍击式均质器中,用均质器拍打1min~2min,制成1:10的样品匀液。
注意:样品匀液的pH值应在6.5~7.5之间,必要时可用1 mol/L无菌氢氧化钠或1mol/L无菌盐酸溶液调节。
均质完毕后,做好标记,将均质袋置于样品框中。
在装有9mL生理盐水的无菌试管上做好标记,用1mL无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入装有9mL生理盐水的无菌试管中,稀释前后试管口都应在酒精灯上灼烧片刻。加塞后于振荡器上混合均匀,制成1:100的样品匀液。同理,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。稀释样品时,注意吸管或吸头尖端不得触及稀释液面;每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。
接种及培养
在事先经灭菌处理的培养皿底部做好标记。根据对样品污染状况的估计,选取2~3个适宜的连续稀释度。本次演示只做1:10和1:100的样品稀释液。
用无菌吸管吸取1:10样品稀释液1mL,加入到培养皿中,备用。同理,加入1:100稀释液和空白液。注意,每个稀释度应接种2个无菌培养皿,空白液即为以1mL生理盐水代替1mL样品稀释液。
加完样品梯度稀释液后,即可倾倒培养基。倾倒前应将锥形瓶的瓶口在酒精灯上充分灼烧。灼烧后及时倾注15mL~20mL结晶紫中性红胆盐琼脂于每个培养皿中,小心旋转培养皿,将培养基与样液充分混匀。倾注培养基时应将锥形瓶口尽量伸入培养皿内,防止倾倒时培养基挂在培养皿的内壁或外壁上,且倾倒过程应果断,防止培养基沿锥形瓶外壁流出、滴落。培养基的温度以46℃为宜,不能过高或过低,温度过高不利于操作且对菌体有害,温度过低培养基迅速凝固,菌体不能在培养皿内均匀的分布,导致菌落计数困难。转动培养基时用力须均匀,防止培养基沾到培养皿上盖或洒出。
倒完培养基后,静置培养皿,等待培养基冷却凝固。
待培养基凝固后,再加3mL~4mL 结晶紫中性红胆盐琼脂覆盖平板表层。加两次培养基的主要目的是:使菌体均在培养基内部生长,以便于观察典型菌落形态。等待培养基冷却凝固。待培养基凝固后,翻转平板,置于培养箱中于36℃±1℃条件下培养18h~24h。
平板菌落计数
选取菌落数在15CFU~150CFU之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落,其中典型菌落的特征为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5mm或更大。
证实实验
先在煌绿乳糖胆盐肉汤管上做好标注。将接种环置于红外灭菌器中灭菌,再用接种环从结晶紫中性红胆盐琼脂平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,分别移种于煌绿乳糖胆盐肉汤管内,振摇均匀。每次接种后都应及时将接种环在灭菌器中灭菌。将接种完的煌绿乳糖胆盐肉汤管置于培养箱中,于36℃±1℃条件下培养24h~48h。培养完毕后,观察煌绿乳糖胆盐肉汤管中产气情况。凡管内倒管有气泡者,即可报告为大肠菌群阳性。
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