DNA片段的克隆需要合适的载体，载体或是质粒，或是噬菌体，或是病毒，通常大多经过人工改造[地的。作为载体必须具备两条件：一是该载体在细胞内必须能自主复制，即必须具备复制原点；二是该载体必须具备适合的酶切位点，且这些酶切位点不在复制原点区域内。以上两条，保证了载体的可繁殖性和可利用性。为了便于获得阳隆克隆，载体上常有筛选标记，如对抗菌素的抗性，某些基因产物的显色反应等。
一、质粒
常用的有pBR322，pUC系列质粒等。
（一）pBR322质粒是4362bp的环状双链DNA载体，有2个抗药性基因（四环素和氨苄青霉素），一个复制起始点和多个用于克隆 的限制酶切点。当缺失抗药性基因的大肠杆菌被pBR322成功地转化时，它便从该质粒获得了抗生素抗性。两个抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的单一酶切位点。一般只选一个抗生素基因作为插入外源DNA之用。外源DNA插入后该抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因则作为转化细菌后筛选阳性克隆 之用。
（二）pUC系列质粒是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
二、单链丝状噬菌体和噬粒
（一）大肠杆菌丝状噬菌体包括M13噬菌体f噬菌体等，其基因组 均是单链闭环DNA分子，其中M13mp系列克隆载体是对野生型M13加以改造，插入了多克隆位点和LacZ基因后的载体，所以也是可以利用IPTG和X-gal作蓝白筛选的，M13感染大肠杆菌后，即在菌体内酶的作用下，以感染性单链DNA（正链）为模板，转变为双链DNA，称作复制型DNA（RF DNA）。一般当每一个细胞内有100-200个RF DNA拷贝时，即停止复制，产生有感染性的完整的单链丝状噬菌体并分泌离开菌体。感染M13的大肠杆菌可继续生长，并不发生裂解，但生长速度则较正常菌慢，取感染M13的细菌培养液离心，即可从菌体中提取RF DNA，供限制酶切割等分子克隆操作之用；从离心后的上清液中，可用聚乙二醇（PEG）沉出噬菌体颗粒，提取单链DNA（ss DNA）供DNA序列分析，体外定位突变等使用。
（二）噬粒（phagemid）在质粒DNA中插入一段单链噬菌体的复制起始点DNA，即构成了噬粒，如pGEM-3Zf（-）就是一种噬粒。噬粒可像一般质粒一样操作，但当需要制备单链DNA时，就需要在培养时加入辅助噬菌体，常用的辅助噬菌体有M13KO7和R408。培养好的菌液在离心除去菌体后，上清中加入PEG即可沉出含有单链DNA的颗粒。噬粒也常用于DNA序列分析和体外定位突变。分子克隆常用载体除了上述两类以外，还有 噬菌体和粘粒，详细情况可参阅有关资料。
由于分子克隆载体的大小决定外源DNA插入片段的大小，两者呈反比关系，因而在建立载体时千方百计地减小载体分子量。对于穿梭载体，因为复制起点和标记基因具有生物特异性，所以载体上需要同时具有两个以上的复制起点和标记基因。
选择克隆载体的几个重要参数：
1、实验对象
2、实验性质
3、载体容量
4、 合适克隆位点
5、载体的稳定性
6、克隆载体的特点
实验对象：
1、供体：遗传背景与DNA特点等，其中包括染色体DNA大小，基因大小与结构，碱基组成，目的基因的产物特点以及遗传物质的传递方式等。
2、受体：各种中间宿主与终宿主的遗传背景，如遗传物质的传递方式（包括认为的方法），DNA限制修饰系统，DNA重组基因特点，基因产物修饰系统，即转录与翻译后修饰系统。
实验性质：
分子克隆的一般程序包括以下几步：
1、分离供体DNA或RNA（mRNA）和载体DNA
2、构建基因文库或cDNA文库
3、目的基因或cDNA克隆的筛选
4、目的基因或cDNA片段的鉴定：限制酶谱，次克隆，核苷酸序列分析，基因结构分析等
5、基因表达与调控机理的研究
克隆载体容量：
M13mp载体 <4 kb
细菌质粒载体 <10kb
λ载体 <23kb
cos质粒载体 <48kb
P1载体 <95kb
pEASY载体 ∽1000kb
合适的克隆位点：
单克隆位点和多克隆位点；单克隆位点的克隆载体就能够很方便的在基因上设计酶切位点，如pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆载体，双抗，无多克隆酶切位点；而多克隆位点的克隆载体中，酶切位点多，相对于实验来说也更容易。如pEASY-T1 Cloning Kit克隆载体，双抗性，酶切位点多。
克隆载体的稳定性：
克隆载体的稳定性决定着实验的成败，如果克隆载体在基因克隆过程中足够的稳定，而且能够多次的重复利用，那么此克隆载体的稳定性很好。如pEASY-T5 Zero Cloning Kit克隆载体的研发数据显示10kb目的基因可以稳定的连接。
克隆载体的特点：
不同品牌的克隆载体或多或少都有着不同的特性差异，即使基本的原理和作用都相同，但是一些细小的差别能决定着生物实验过程的成败。如pEASY系列的克隆载体就有着5min快速克隆，克隆稳定性极强，最大的一个特点是一般的克隆载体需要在中间的实验步骤加入T4连接酶，将目的基因和载体基因序列链接在一起，而pEASY系列克隆载体属于一体式克隆载体，在载体基因的两端就附带了“胶水”，能有效的使目的基因连接到载体基因上。