人工抗原 用化学合成法或基因重组法制备含有已知化学结构决定簇的抗原, 称之为人工 抗原.它可包括人工结合抗原、人工合成抗原和基因重组抗原.无论对免疫学理 论研究和分子疫苗的制备都具有重要意义. (一)人工结合抗原 将无免疫原性的简单化学基团与蛋白质载体偶联, 或将无免疫原性的有机分子 如二硝基苯(DNP)或三硝基苯(TNP)与蛋白质载体结合,形成载体-半抗原 结合物,均属人工结合抗原.应用此种抗原证明了抗原与抗体特异结合的化学基 础,以及在抗体生成过程中 T 与B细胞的协同作用. (二)人工合成抗原 用化学方法将活化氨基酸聚合,使之成为合成多肽,只由一种氨基酸形成的聚 合体称为同聚多肽,如由左旋赖氨酸形成的共同聚多肽(PLL).由二种或二种 以上氨基酸形成的聚合多肽称为共聚多肽,如由酪氨酸、谷氨酸与多聚丙氨酸和 赖氨酸组成的聚合成多肽(T、G)-AL.应用这种人工合成多肽可研究氨基酸种 类、序列与蛋白质抗原性及免疫原性的关系,也可研究机体遗传性与免疫性的关 系. 对天然蛋白质抗原性的研究证明,任何一个氨基酸片段,只要具有合适的构型, 都有抗原性,甚至一小段合成的小肽与合适的载体相联接,也能诱导产生抗体, 并能与其天然分子构型相结合,这就提示,可根据天然蛋白质抗原的免疫原性片 段进行氨基酸序列分析,或由其编码 DNA 推导的氨基酸序列,进行构建人工合 成多肽疫苗. (三)基因工程抗原 近年来由于分子生物学技术的进步, 已有可能将编码免疫原性氨基酸序列的基 因克隆化并与适当载体(如细菌粒或病毒)DNA 分子相结合,然后引入受体细 胞中(如原核细胞的大肠杆菌或真核细胞酵母菌及哺乳类动物细胞)使之表达, 即能获得免疫原性之融合蛋白,经纯化后可做为疫苗,此即基因工程疫苗. 应用分子生物学技术制备基因重组疫苗的另一进展,是将目的抗原决定簇的 DNA 序列插入另一种比较安全的活病素基因组中(如牛痘苗),制备所谓重组 感染载体多价疫苗. 随着 70 年代分子病毒学的发展,特别是对病毒基因的结构、功能与复制方面 知识的积累,为迅速研制病毒亚单位疫苗、合成多肽苗以及基因工程疫苗奠定了 基础. 一些重要病毒如乙型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒以及流感病毒等的 蛋白质多肽,都已利用基因工程进行了成功的表达,有的已进入临床试验阶段. 我国也报导了正在进行研制基因工程乙型肝炎病毒疫苗和在牛痘苗表达系统中 研制乙肝病毒的重组感染载体的多价疫苗. 能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应 、又不能单独激 发人或动物体产生抗体的抗原.它只有反应原性,不具免疫 原性,又称不完全抗原.大多数多糖和所有的类脂都属于半 抗原.如果用化学方法把半抗原与某种纯蛋白的分子(载体) 结合,纯蛋白会获得新的免疫原性,并能刺激动物产生相应 的抗体.半抗原一旦与纯蛋白结合,就构成该蛋白质的一个 抗原簇.一些比一般半抗原分子量小,但有特异结构的化学 活性基团物质( 如青霉素、磺胺剂等 ) ,称为简单半抗原. 当简单半抗原进入过敏体质的机体时,能与体内组织蛋白结 合,成为完全抗原,这种完全抗原可引起超敏反应. 半抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生 抗体的抗原.也就是说它只有反应原性,不具免疫原性.而抗原(全抗原)是要 同时具备这两种特性的. 但是用化学方法把半抗原与某种纯蛋白的分子(载体)结合,纯蛋白会获得新的 免疫原性,并能刺激动物产生相应的抗体,从而成为真正的抗原. 额,换句话说,就是半抗原上有抗原决定簇,但个子太小免疫细胞看不到他,跟 它结合的蛋白质够大,但上面又没有抗原决定簇.所以它们结合后就又够大有又 醒目标志了. 【半抗原交联抗体法(Hapten –Coupled techniques)】 近年来,为提高敏感性和减低非特异性染色,有些学者(Cammisuli 1976; Jassani 1981; Falini 1983) 在常规免疫细胞化学技术的基础上,发展了半抗原 交联抗体法,可作免疫荧光或免疫酶染色.本法的基本原理是应用半抗原标记第 一抗体.常用的半抗原有阿散酸,即对氨基苯砷酸(Arsanilic acid, ARS),对氨 基苯酰甘氨酸(P—aminobenzoyl glycine),亚对氨苯酰甘氨酸 (N—P—aminobonozyl glutamic acid)和二硝基苯氨基丙睛亚胺酸脂 (dinitrophenyl aminopropionitrile imido ester, DNP).通过酰胺化反应把半抗 原结合到抗体分子上. 在间接法 (二步法) 先以半抗原标记的特异性抗体 中, (第 一抗体) 孵育切片, 然后加入半抗原的标记抗体, (标记物可为荧光素或酶) (图6-4).在PAP 染色(三步法)中,先用半抗原标记的第一抗体孵育切片,再加 未标记的抗半抗原特异性抗体作为桥抗体,第三步加半抗原交联的 PAP 与之反 应,并作酶的呈色反应(图6-5).第一和第三抗体分别为半抗原标记的特异性 抗体和以半抗原标记的抗酶抗体制备的含半抗原的 PAP 复合物.本法具有许多 优点,主要是:①敏感性高.由于本法是通过酰胺化反应标记半抗原,对抗体活 性损失极小,抗体保留较高的活性,能结合较大量的半抗原,平均每个球蛋白分 子可同时结合 20 个半抗原分子,每个半抗原又可用抗半抗原抗体相结合,特异 免疫反应明显放大,其敏感性明显高于常规的免疫酶和免疫荧光染色技术,特别 有助于发现滴度低的同种抗血清和含抗原量较少的组织.②可用于双重免疫染 色. 利用两种交叉反应的半抗原如阿散酸和对氨基苯酰甘氨酸分别标记来自同一 种动物的两种特异性(第一抗体)血清,应用两步法或三步法,即可在同一张切 片内同时显示两种不同的抗原.③由于特异性强、敏感性高,因此背景染色低. 抗原分完全抗原和半抗原.完全抗原的本质是蛋白质或者糖蛋白,半抗原多为多 糖、脂类和一些小分子化学物质(比如青霉素),半抗原进入体内与体内蛋白质 结合后才能成为完全抗原. 抗原决定簇是抗原表面决定抗原性的特殊集团,一般为糖链、脂链或特殊的化学 功能集团.半抗原与蛋白质结合之后,原先的半抗原分子就成为了决定簇. 免疫学中与抗原偶联的载体蛋白的选择原则 免疫学中与抗原偶联的载体蛋白的选择原则 人工抗原合成常用的载体 载体表面应首先应具有化学活性基团, 这些基团可以直接与抗生素或农药分子偶 联,这是化学偶联制备抗原的前提;其次,载体应具备一定的容量,可以偶联足 够的分子;载体还应该是惰性的,不应干扰偶联分子的功能;而且载体应具有足 够的稳定性,且应该是廉价易得的. 常用来作为合**工抗原的载体蛋白质有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥 孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等.这些 蛋白质分子中的 α 和ε-氨基(等电点 8 和10)、苯酚基、巯基(等电点为 9)、 咪唑基(等电点为 7)、羧基(等电点 2~4,大部分来自天冬氨酸或谷氨酸的 β和γ-羧基)等在等电点 pH 条件下,一部分成为质子,另一部分未质子化的亲核 基团则具有反应活性,可与半抗原中的对应基团结合.当然,这些基团的反应性 也取决于蛋白质各种氨基酸残基的微环境.牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋 白(HAS)分子中含有大量的赖氨酸,故有许多自由氨基存在,且在不同 pH 和 离子强度下能保持较大的溶解度.此外,这些蛋白质在用有机溶剂(如吡啶、二 甲基甲酰胺)溶解时,其活性基团仍呈可溶状态,因此,这两种蛋白质是最常用 的载体蛋白质[30].近年来,有研究报道用人工合成的多聚肽(最常用的是多聚赖 氨酸)作载体,表现出能增加半抗原的免疫原性,从而使产生征对半抗原的特异 性抗体可能性增加,被广泛应用[31,32]. 1.2.2 人工抗原合成方法 小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会受到偶联物的浓度及其相对比例、 偶联剂的 有效浓度及其相对量、缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH 以及半抗原的稳定 性、可溶性和理化特性等因素的影响.通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与 载体蛋白共价结合,不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行.一般是由半抗 原上的活性基团决定偶联合成的方法,常用的方法如下: 1.2.2.1 分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联 1)混合酸酐法(mixed anhydride method):也称氯甲酸异丁酯法.半抗原上 的羧基在正丁胺存在下与氯甲酸异丁酯反应,形成混合酸酐的中间体,再与蛋白 质的氨基反应,形成半抗原与蛋白质的结合物 2)碳二亚胺法(CDI):碳二亚胺(EDC)使羟基和氨基间脱水形成酰胺键,半抗 原上的羧基先与 EDC 反应生成一个中间物,然后再与蛋白质上的氨基反应,形 成半抗原与蛋白质的结合物(见图 1.5).EDC 被称作零长度交联剂之一,因为 它作为酰胺键的形成介质并没有形成手臂分子. 此连接方法十分简便,只需将载体蛋白质和抗原按一定比例混合在适当的溶液 中,然后加入水溶性碳化二亚胺,搅拌 1~2h,置室温 24h,再经透析即可.如 果半抗原分子中不含羧基,可通过某些化学反应引入羧基.在引入羧基后,也可 用上述方法进行偶联. 1.2.2.2 含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 1)戊二醛法:双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形 成schiff 键(-N=C<,在半抗原和蛋白质间引入一个 5 碳桥.这一反应条件温和, 可在 4~40℃及pH6.0~8.0 内进行,操作亦简便,因此应用广泛.戊二醛受到 光照、温度和碱性的影响,可能发生自我聚合,减弱其交联作用,因此最好使用 新鲜的戊二醛. 2)重氮化法:用于活性基团是芳香胺基的半抗原,芳香胺基与 NaNO2 和HCl 反应得到一个重氮盐,它可直接接到蛋白质酪氨酸羧基的邻位上,形成一个偶氮 化合物(见图 1.6). 1.3.2.3 含羟基半抗原的偶联 1)琥珀酸酐法:半抗原的羟基与琥珀酸酐在无水吡啶中反应得到一个琥珀酸半 酯(带有羧基的中间体),再经碳二亚胺法或混合酸酐法与蛋白质氨基结合,在半 抗原与蛋白质载体间插入一个琥珀酰基(图1.7). 2)羰基二咪唑法:N,N'-羰基二咪唑是引入羰基的高活性试剂,在肽合成中首 次表明了是形成极好的酰胺键试剂[33].含羟基的分子同羰基二咪唑反应,形成 中间体咪唑基甲酸酯,它能和 N-亲核试剂反应,得到 N-烷基化的甲酸酯键,通 常蛋白质通过 N-端(α-氨基)和赖氨酸侧链的(ε-氨基)和分子形成不带电的类似尿 烷的衍生物,具有极好的化学稳定性. 1.2.3 影响人工抗原质量的因素 人工抗原免疫原性的好坏,与多种因素有关.对不同的物质,影响免疫原性的因 素并不完全相同, 常常需要在得到抗体后对免疫偶合物的具体合成方法进行重新 调整.但总的说来,影响人工抗原质量的因素主要有: 1) 偶联比 偶联比过去人们认为,联接到蛋白质分子上的半抗原数目要尽可能多.但实验证 明,过多的半抗原并不能得到预期的结果,这是因为载体上覆盖的半抗原分子过 多时, 可能不利于载体与淋巴细胞表面结合, 不能使载体引起免疫反应. 实际上, 每个载体分子连接上一个半抗原分子就足以产生抗体.有人认为,以BSA 为例, 连接到蛋白分子上的半抗原数以 5~20 为宜.而荣康泰等用不同的载体制备对 氧磷的人工抗原时,却发现各种载体的分子量不论是否接近,最佳结合比都不尽 相同,并建议为了取得最佳免疫效果,应逐个确定各种载体的最佳结合比. 2) 偶联桥 有研究者认为,一定长度的手臂的介入,有助于半抗原暴露在外面,利于所产生 抗体专一性的增强,如吴颂如等〔34〕发现,通常愈远离载体蛋白的基团,其 特征反应愈明显.但也有一些研究者发现,手臂结构对免疫检测经常有不利的影 响,有时产生的抗体对手臂结构亲和力特别强,对待测小分子亲和力却很弱,因 此造成对特异性抗体检测的干扰.Sionf 等〔35〕认为可以采取两种方法来避免 因偶联桥而造成的不足:一是半抗原上相同位点结合蛋白质,但免疫原和包被抗 原用不同的偶联桥;二是免疫原和包被抗原用相同的偶联桥,但与不同半抗原位 点结合.Frieia〔36〕研究农药酶免疫分析多年,他认为最好的偶联桥是 3~6 个直链的碳原子结构. 3)半抗原的分子空间结构 用来作半抗原的分子最好有分支结构,直链分子难以产生抗体.此外,有些抗生 素或农药有多个可供蛋白质偶联的位点,但据研究报道,不同位点与蛋白质结合 制备的人工抗原产生的抗体效价及亲合力都有差别, 这可能是因为不同位点结合 导致半抗原呈现的空间结构不一样的原因.如合成灭草松和吡虫啉人工抗原时, 当利用半抗原不同位点与载体结合时产生的抗体效价和亲合力明显不一样[37、 38].因此,如果一个分子内有多个不同的结合位点时,最好尽可能利用不同位 点都合成出人工抗原,然后,通过比较,筛选出最好的人工抗原用于制备抗体作 为检测. 1.2.4 人工抗原的质量评定 1.2.4.1 浓度测定 人工抗原的绝对含量常以蛋白质的相对浓度表示(如每 ml 抗原溶液中含有蛋白 质多少 mg).因此测定人工抗原的浓度与测定人工抗原溶液中蛋白质的相对含 量(mg/ml)是一致的(这里也反映出人工抗原越纯,检出的浓度值愈准确). 常用的方法有紫外吸收法、Folin-酚法、双缩脲法、微量凯式定量法、染色结合 法和荧光法等.这里就不一一介绍了. 1.2.4.2 纯度鉴定和结
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