微生物育种的目的就是要人为地使某些代谢
产物过量积累,把生物合成的代谢途径朝人们所
希望的方向加以引导,或者促使细胞内发生基因
的重新组合优化遗传性状,获得所需要的高产、
优质和低耗的菌种.为达到这一目的,必须对微
生物作诱变处理.在这一过程中,诱变和筛选是
微生物育种的两个主要环节.目前,国内微生物
育种界主要采用的仍是常规的理化因子等诱变方
法以及对目标菌株的筛选与检出方法.
1 诱变方法
〗STHZ〗1·1 物理因子诱变
1.1.1 紫外(UV)
DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很强的紫外光
吸收能力,最大的吸收峰在260nm.紫外辐射能
作用于DNA,因此在260nm的紫外辐射是最有效
的致死剂.对于紫外的作用已有多种解释,但研
究的比较清楚的一个作用是使DNA分子形成嘧
啶二聚体,即两个相邻的嘧啶共价连接[1] .二聚
体出现会减弱双键间氢键的作用,并引起双链结
构扭曲变形,阻碍碱基间的正常配对,从而有可
能引起突变或死亡.二聚体的形成,会妨碍双链
的解开,因而影响DNA的复制和转录.紫外辐射
可以引起转换、颠换、移码突变或缺失等[2].
齐秀兰等[3]以妥布霉素产生菌黑暗链霉菌
ATCC17920为出发菌株,经紫外线处理,获得一
株产量较高且稳定的菌株UV-59,其效价比原株
提高92.3%.周建琴等[4]用康乐霉素(K-C)产生
菌的自然突变株ST-91为出发菌株,采用UV诱
变和自然分离纯化的方法,筛选出1株突变株
U10-S-4.发酵条件优化后, 5吨罐上K-C效价比
ST-91提高460多倍.王筱虹等[5]用UV照射红霉
素产生菌红色链霉菌的原生质体,得到比对照菌
株效价提高225.8%的高产菌株.值得注意的是,
白兰芳等[6]以紫外线、光复活处理西罗莫司产生
菌,得到正变株UV-8-61的效价较出发菌株高2
~3倍,且紫外照射后,光复活处理比暗修复处
理的正变率高得多,这与UV处理菌种后必须暗
修复的传统观点恰恰相反.
紫外线是常用的物理诱变因子,是诱发微生
物突变的一种非常有用的工具.由于UV的能量
比X-射线和γ-射线低得多,在核酸中能造成比较
单一的损伤,所以在DNA的损伤与修复的研究
中, UV也具有一定的重要性.
1.1.2 低能离子
低能离子生物学是我国首创的研究领域.离
子注入生物体既存在能量、动量交换过程,又存
在粒子沉积过程.而动量、能量和质量三种作用
都有其不同的生物学效应.离子注入与生物体相
互作用存在峰值.在峰值范围内,注入离子与生
物体相互作用是局部的、双重的和不易修复的.
在离于注入过程中,生物分子将吸收能量,经历
着复杂的物理和化学的变化,这些变化的中间体
是各类自由基.所产生的活性自由基,能引起其
·95·洛阳师范学院学报2002年第2期
它正常生物分子的损伤.可使细胞中的染色体畸
变, DNA链发生断裂,也可使质粒DNA造成断裂
点[7, 8, 9].
王纪等[10]通过离子注入诱变筛选产麦角甾
醇酵母高产菌,得率较出发菌提高55%~60%.
颉红梅等[11]用40Ar14+离子辐照庆大霉素产生菌
绛红小单孢菌,出发菌株的平均效价为1150u/
mL,最高效价为1304u/mL,得到一正变株的平均
效价为1409.7u/mL,最高效价为3580u/mL,正变
率为69.1%.龚加顺等[12]用N+离子注入单宁酸
酶产生菌黑曲霉9701,获得一株产酶活力
34.50mo1/s的高产菌株,比原始菌株酶活力提高
了2.68倍,且酶活性稳定.
由于低能离子在微生物诱变育种中的高效
性,它正在得到越来越广泛的应用.而且因为离
子注入射程的可控性,随着微束技术和精确定位
技术的发展,定位诱变将成为可能[7].
1.1.3 γ-射线
γ-射线属于电离辐射,是电磁波.一般具有
很高的能量,能产生电离作用,因而直接或间接
地改变DNA结构.其直接效应是,脱氧核糖的碱
基发生氧化,或脱氧核糖的化学键和糖-磷酸相
连接的化学键, DNA的单链或双链键断裂.其间
接效应是电离辐射使水或有机分子产生自由基,
这些自由基与细胞中的溶质分子起作用,发生化
学变化,作用于DNA分子而引起缺失和损伤.此
外,电离辐射还能引起染色体畸变,发生染色体
断裂,形成染色体结构的缺失、易位和倒位等[2].
钱玉英等[13]用60Coγ-射线诱变处理酸性蛋
白酶产生菌黑曲霉CPu菌株,获得一高产菌株.
其酸性蛋白酶活力比出发菌株提高近4倍.王海
彬[14]以阿维菌素产生菌阿维链霉菌为出发菌株,
进行60Co诱变处理后,筛选到一高产突变株,其
Bla组分摇瓶发酵单位可达16O0μg/mL,比出发菌
株提高33%.邱玉棠等[15]用60Co射线辐照肌苷
产生菌枯草杆菌,选育出一肌昔高产突变株的肌
苷产量达25.18g/L,比出发菌株提高24.7%,菌
株产肌苷能力稳定.
电离辐射通常用于不能使用其他诱变剂的诱
变过程.γ-射线是电离生物学上应用最广泛的
电离射线之一,实际应用的电离辐射还有X-射
线、β-射线和快中子等.
1.1.4 激 光
激光是一种光量子流,又称光微粒.激光辐
射可以通过产生光、热、压力和电磁场效应的综
合应用.直接或间接地影响有机体,引起细胞
DNA或RNA.质粒.染色体畸变效应,酶的激活
或钝化,以及细胞分裂和细胞代谢活动的改变.
光量子对细胞内含物中的任何物质一旦发生作
用,都可能导致生物有机体在细胞学和遗传学特
性上发生变异.不同种类的激光辐射生物有机
体,所表现出的细胞学和遗传学变化也不同[16].
赵炎生等[17]用激光诱变赤霉菌,其产生的
赤霉素中活性最高的GA3效价比出发菌株提高
113.7%.陈五岭等[18]用He-Ne激光对四环素产
生菌金霉素链霉菌原生质体诱变处理,四环素产
量比亲本株平均提高9.32%,最高提高20.6%.
赵炎生等[19]对比紫外, He-Ne激光, Nd: YAG倍
频脉冲激光对脱落酸产生菌的诱变效果,其中
He-Ne激光诱变正变率为5.6%; Nd: YAG倍频
脉冲激光诱变正变率为19.6%;Nd: YAG倍频脉
冲激光诱变辐照次数400次时效果较好,所得的
高产菌株效价提高率可达60%以上.
作为一种新的诱变源,激光以其高亮度、高
方向性、高相干性以及单色性,在微生物育种领
域已得到广泛应用.而且,不同种类的激光辐照
微生物,所表现出的细胞学和遗传学变化也不
同,这也给微生物诱变育种提供了便利条件.
1.1.5 空间条件、磁场、高温
国家开展863高技术航天领域空间诱变育种
的研究,取得了很好的成绩.空间环境具有强辐
射、微重力、高洁净、高真空等特点,有诱发突
变的因素[20].在空间生命科学领域中,微重力和
宇宙射线的生物学效应,是最重要的.宇宙射线
作用于生物体的最直接效应是引起生物体内发生
电离,产生许多次高能电子和自由基,自由基对
生物大分子造成损伤,使生物产生变异病变,组
织损伤致死等效应[21].
贾士芳等[21]把枯草芽孢杆菌314菌株———
超氧化物歧化酶(SOD)产生的菌经我国“92106”科
学返回式卫星搭载之后,酶活性提高2倍多,而
且生长速度加快.李金国等[20]将庆大霉素等产
生菌棘孢小单孢菌,搭载“90105”科学返地卫星
后,菌株产抗平均水平提高,初筛时最优菌株比
对照增产27·55%,复筛最优菌株效价比对照提
高18%.
磁场及高温等诱变方法在微生物育种中也有
运用,但并不很多.
1.2 化学因子诱变
化学诱变剂是一类能和DNA起作用而改变
·96·洛阳师范学院学报2002年第2期
其结构,并引起DNA变异的物质.其作用机制都
是与DNA起化学作用,从而引起遗传物质的改
变,因而诱变效应与其理化特性有很大关系[2].
1.2.1 烷化剂
NTG是最有效,也是用得最广泛的化学诱变
剂之一.依靠NTG诱发的突变主要是GC—AT转
换,另外还有小范围切除、移码突变及GC对的
缺失.在自然条件下NTG容易分解,而在酸性
(PH5.5)条件下会产生HN02.虽然HNO2本身就
是诱变剂,但在NTG有活性时(PH6~9),它却无
诱变效果.在碱性条件下,NTG会形成重氮甲烷
(CH2N2),它是引起致死和突变的主要原因.它
的效应很可能是CH2N2对DNA的烷化作用引起
的[2].
李瑶等[22]用NTG对可产生耐高温α-淀粉酶
的高温菌B·sp-JF1进行诱变选育,得到酶活性提
高为原菌2·23倍的一株突变株.蔡晶晶等[23]把
产生洛伐他汀的土曲霉经NTG诱变,选出一突变
株,产生洛伐他汀的能力较出发菌株提高66%.
另外,烷化剂中的EMS和DES,也是应用较
为广泛的诱变剂.唐宝英等[24]以黑曲霉JW3039
为出发菌株,通过EMS多次诱变及最适培养和发
酵条件的换索,使其酸性蛋的酶产量从1800~
2000u/mol提高到3300u/mol.李继衍等[25]用DES
处理酵母,使其将苯甲醛转化为L-苯基乙酰基甲
醇的能力提高23.53%.
1.2.2 其 它
除烷化剂外,常用的化学诱变剂还有嵌合
剂,如吖啶橙;碱基类似物,如5-溴尿嘧啶(5-
Bu);以及抗生素类等.
王世梅等[26]用吖啶橙对阿扎霉素B产生菌
进行诱变处理,获一高产株的产量为l100mg/L,
而出发株产量为240mg/L,且传代稳定.程世
清[27]用5-Bu对产色素菌(分枝杆菌T17-2-39)细
胞进行诱变,生物量平均提高22.5%.范王名琦
等[28]用磷霉素处理庆大霉素产生菌,获得GMCla
提高101%的高产株.强华等[29]比较了庆大霉
素、丝裂霉素C、红霉素等对雷帕霉素产生菌吸
水链霉菌的原生质体的诱变作用.结果表明,庆
大霉素的处理效果较好,产素能力提高60%.
总之,化学诱变剂在微生物育种中的应用较
多,有的诱变效果也较为理想.但因其对人体的
致畸致癌作用,实际应用中也受到一定的限制.
1·3 复合因子诱变
复合诱变包括:两种或多种诱变剂的先后使
用;同一种诱变剂的重复作用;两种或多种诱变剂
的同时使用.普遍认为,复合诱变具有协同效
应.如果两种或两种以上诱变剂合理搭配使用,
复合诱变较单一诱变效果好.
胡永兰等[30]用UV和DES复合处理梧宁霉
素产生菌不吸水链霉菌,得到一产素较高的突变
株,产素效价比出发株提高291.72%.普为民
等[31]用UV和5′-氟尿嘧啶复合诱变处理5′-腺苷
酸脱氨酶产生菌,以及条件优化后,使菌株的酶
活性提高14.6倍.齐秀兰等[32]用LiCl、UV和博
来霉素三重复合处理赖氨酸产生菌钝齿棒杆菌,
筛到一高产菌株的L-赖氨酸产量较出发菌株提
高17·7%.张怡轩等[33]应用磁场复合吖啶橙处
理氨甲酰-妥布霉素产生菌黑暗链霉菌,得到高
产株的总效价、CTB含量均提高64.0%.
复合因子较单一因子诱变效果有很大优势.
但因目前大多微生物,尤其是抗生素产生菌的遗
传背景不清楚,往往对诱变剂,特别是复合诱变
剂的选择使用,带有很大的盲目性.
2 筛选方法
2·1 初筛和复筛
除了诱变过程的最适条件外,突变菌株的分
离和筛选也是微生物育种的关键环节.筛选一般
分初筛和复筛两个阶段.初筛可在摇瓶中完成,
也可采用琼脂块法,即将适宜的反应试剂喷涂在
平板上正在生长的菌落中,或采用混合指示剂在
培养基上染色,直接观察特定的酶活性,或者将
待测菌落打块,放置在涂有特定菌的检定盘上,
依抑菌圈的大小定量测定菌株的抗菌活性物质的
含量.初筛得到的高产菌株,再进行摇瓶复筛,
对其生产性能作更精确的定量测定.
2·2 随机筛选和定向筛选
在初筛阶段进行的高产菌株的检出方法又有
随机筛选和定向筛选之分.随机筛选具有很大的
盲目性,且工作量很大.定向筛选常用来筛选抗
性突变株和营养缺陷型突变株,其筛选效率远高
于随机筛选.
2·2·1 抗性突变株的筛选
抗性突变包括抗代谢产物,抗代谢类似物,
抗噬菌体,抗前体及其类似物,抗重金属离子或
抗特定的有毒物质[2],抗培养基中的某些成分
等.代谢产物等的积累,往往对其自身的合成具
有反馈调节作用,筛选的抗性突变株,可以消除
这些不利因素的抑制或阻遏作用,达到积累目的
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产物的作用.这些方法在抗生素生产中尤为重
要,抗生素产生菌的抗性基因与抗生素合成的结
构基因和调控基因紧密联锁而易发生共突变[29].
在抗生素菌种选育中,抗性突变株往往就是高产
突变株.
于秀莲等[34]对庆大霉素产生菌进行了摇瓶
耐受高浓度庆大霉素试验,从耐受8000u/mL庆大
霉素的摇瓶中,筛得一高产株,其摇瓶效价较出发
菌株提高22·8%.力复霉素的生物合成与谷氨酰
胺合成酶的比活力有正相关性,张益芬木等用NTG
诱变处理力复霉素产生菌,筛得突变株产量最高
者为原种的2·5倍[35].金志华等[36]用UV诱变处
理替考拉丁产生菌,以缬氨酸氧肟酸(TA2-2组分
的合成前体L-缬氨酸的结构类似物)为筛选剂,
获得一突变株总效价提高35%, TA2-2组分含量
达60.09%,而自然分离株TA2-2最高者仅为
39·16%.李霞等[37]把那西肽产生菌经NTG处理
和对Cu2+, Mn2+耐受选育,获得一突变株的产
量是出发菌株的1.6倍.刘连碧等[38]采用链霉素
抗性筛选法,用含链霉素高氏一号合成培养基筛
选柔红霉素产生菌对链霉素的抗性自发突变株,
获得了产抗生素能力是原菌株的1.5倍左右的突
变株.杨博等[39]通过对乳链菌肽产生菌的基因
分析,推测出乳链菌肽强免疫性菌株也有可能是
高产菌株,并用这一方法,高效地筛选到一高产
菌株,发酵液效价达到1527IU/mL.
2.2.2 营养缺陷型的筛选
营养缺陷型的本质是一种减低或消除末端产
物以解除反馈抑制,使代谢途径中的中间产物或
分枝合成途径中的末端产物得以积累[2].
刘长云等[40]以肌苷产生菌枯草芽孢杆菌为
出发菌株,经UV诱变处理获得一株具有腺嘌呤、
组氨酸、苯丙氨酸、硫胺素四重营养缺陷型并对
8-氮杂鸟嘌呤、6-巯基嘌呤有双重抗性的突变株,
摇瓶发酵产肌苷由6.65mg/mL提高到27·43mg/
mL,且性状稳定.
微生物育种中的筛选环节极为繁杂,工作量
很大.同时,代谢产物生产能力强弱是数量性
状,数量性状是微效多基因与环境条件相互作用
的结果.由于发酵条件的不稳定性,发酵及测定
操作中的人为误差,使得准确筛选的困难很大.
如果建立起自动化测量等工作,效率及准确率将
会大大提高.
目前,重组DNA和原生质体融合等方法已
用于菌种选育,但用于大规模生产的还不多,常
规的诱变和筛选方法在微生物育种工作中仍占主
导地位.
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