能将两段DNA拼接起来的酶叫DNA连接酶。该酶催化DNA相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA单链缺口封合起来。大肠杆菌和动植物细胞中都有DNA连接酶。为将限制性酶切片段共价地连接起来，可使用T4DNA连接酶，或大肠杆菌连接酶。T4DNA连接酶是分子量58kD的多肽，是T4噬体感染大肠杆菌而产生的。在连接反应中以ATP为辅助因子，是应用最广的连接酶，有商品供应。它的用途是：①连接带匹配粘端的DNA分子，②使平端的双链DNA分子互相连接或合成的接头相连接。大肠杆菌DNA连接酶能使互相匹配的5′突出端和3′突出端的双链DNA连接，反应中以NAD+作为辅助因子，基因工程不常用。