HPSEC原理

Question

HPSEC——high-performance size-exclusion chromatography
高效尺寸筛析色谱法

求其分析原理

Answer 1

原理：排阻色谱法也称空间排阻色谱或凝胶渗透色谱法，是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。排阻色谱的色谱柱的填料是凝胶，它是一种表面惰性，含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质。凝胶的孔穴仅允许直径小于孔开度的组分分子进入，这些孔对于流动相分子来说是相当大的，以致流动相分子可以自由地扩散出入。对不同大小的组分分子，可分别渗入到凝胶孔内的不同深度，大个的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内，但进不了小孔甚至于完全被排斥。小个的组分分子，大孔小孔都可以渗入，甚至进入很深，一时不易洗脱出来。因此，大的组分分子在色谱柱中停留时间较短，很快被洗脱出来，它的洗脱体积很小，小的组分分子在色谱柱中停留时间较长，洗脱体积较大，直到所有孔内的最小分子到达柱出口，完成按分子大小而分离的洗脱过程。尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。
排阻色谱的固定相一般可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富有弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。
（1）软性凝胶如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶涨到它干体的许多倍。它们适用于水溶性作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜在高效液相色谱中。
（2）半刚性凝胶如高交联度的聚苯乙烯。常以有机溶剂作流动相。
（3）刚性凝胶如多孔硅胶、多孔玻璃等，它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。
色谱分离方法的选择：
要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的了解样品的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围。选择色谱分离方法的主要根据是样品的相对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、化学性质。
一、相对分子质量
对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比较好，加热又不易分解的样品，可以选择气相色谱法进行分析。相对分子质量在200～2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于2000，则
可用空间排阻色谱法。
二、溶解度
水溶性样品最好用离子交换色谱法和液液分配色谱法；微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用离子交换色谱法；油溶性样品或相对非极性的混合物，可用液-固色谱法。
三、化学结构
若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的化合物（例如配位体及有机螯合剂），可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液液分配色谱也都能顺利地应用于离子化合物；异构体的分离可用液固色谱法；具有不同官能团的化合物、同系物可用液液分配色谱法；对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。

Answer 2

是20世纪60年代发展起来的一种快速简便的生物化学分离分析方法。基本原理是指混合溶质的分子按其分子量的大小不同，分别先后流出色谱柱而被分离。色谱分离中的固定相(凝胶)是一种不带电荷的、具有三维空间、多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于凝胶颗粒之外，因而具分子筛的性质，因整个色谱过程一般不变换洗脱液，好像过滤一样，故也称凝胶过滤色谱，又因使用的固定相为凝胶，故又称为凝胶色谱(gel chromatography；gel filtration chromatography; GFC)。