逆转录PCR（RT-PCR）在逆转录这一步中，如何设计特异性引物

Question

我想要逆转录流感病毒的一个基因，打算用两步法，在逆转录这一步上，对逆转录引物怎么设计不明白。由于是病毒，我不能用oligo dt引物了，我想用特异性引物，那么怎么设计逆转录引物呢？直接用第二步的PCR引物当做逆转录引物可以吗？还是得再设计一条逆转录引物？

Answer 1

两步法的话，第一步就不用基因特异引物，直接用oligo dt引物（或者oligo dt+随机引物），反转录得到的整套cDNA模板，也就包括了目的基因模板。第二步，再用Primer5.0设计特异引物扩增就行了。

Answer 2

我们这做植物病毒的，我们是用第二步PCR的反向引物来代替oligo dt。

Answer 3

前段时间听我师姐说，他们以Hela 细胞总RNA为模板，以Oligo（dT）18为引物，用BIOG Super cDNA Synthesis Kit催化进行逆转录，50℃反应30分钟。取1/10cDNA产物进行PCR扩增（β-actin），琼脂糖凝胶电泳，有单一的目标条带出现。

Answer 4

为啥不用random呢