再次请教生物问题

Question

如何防止酶切产物的自连

Answer 1

一般，防止酶切产物自连最常用的就是双酶切，因为产生的粘性末端不同，所以很难发生自连。但实际上最后筛选的时候经常也会出现空载体的情况，这个很大一部分原因是有部分载体没有切动，并不是载体自连的问题。这些没有切动的载体转化率是非常高的，这是转化过程中假阳性的最大来源。载体自连最容易发生的情况有两种，一种是单酶切，一种是平末端连接。这两种情况下，通常为了防止载体自连会对酶切后的载体使用碱性磷酸酶处理，将DNA 5‘端的－P基团置换成-OH，这样会一定程度的防止载体自连。

Answer 2

我们一般都会采用双酶切的方法，相对于两种不同限制性内切酶的活性而采取不同的酶浓度，再选择buffer，注意双酶切两种酶同时进行。我们在切质粒的时候用的是petblue的质粒，双酶切37摄氏度5个小时，双酶切由于两种限制酶切出来的末端不一样，一定程度上就可以防止酶切产物自连了。另外在后期连接过程中根据不同的质粒也要进行筛选，至于再防止自连，我的专业不在这边，所以也不太清楚了。来自：求助得到的回答

Answer 3

去磷酸方法如下：
①DNA加入水和去磷酸化缓冲液，5端突出的DNA，每100pmol磷酸基团加入1个单位的CIP，37℃反应30分钟。平末端或3端突出的 DNA，每2pmol 磷酸基团加1个单位CIP，37℃保温15分钟后，再加CIP，55℃反应45分钟(2μg 5kb的线性DNA约含14pmol左右的5磷酸基团)；
②加EDTA(pH8.0)至终浓度为5mmol/L，65℃保温1小时或75℃，10分钟灭活CIP;
③冷却至室温后，吸少量直接进行连接反应。