首先，你要确定你所切下来的目标条带的分子量大小。如果切下来的片段分子量小的话（小于1kb)，经常会出现看不到的情况。因为从质粒上面切下来的片段摩尔数是和质粒一致的，在分子量很小的情况下，等摩尔数的小片段比质粒片段的质量要小很多，而一般的DNA
染料（EB等）的荧光强度都是和质量呈线性关系的，所以很有可能因为片段质量太小而观察不到。如从11kb的载体上双酶切1kb的片段，那么载体片段和切下的片段质量比就是10比1，那么荧光强度也是10比1，如果你的原始酶切的质粒质量就不是很多，那么切下的片段就会根本看不到。解决这个问题的方法就是加大原始酶切反应体系中的质粒的浓度或者电泳时提高上样量。接着，还有一种可能就是两种酶的酶切效率相差甚远，一种
酶活性非常好，一种酶则活性很弱，这样就会产生看不到酶切片段的情况。而造成这种情况，一般都是通用buffer没有选好，所以你要看两种
内切酶的说明书，选择一种两种酶都具有很好活性的buffer进行酶切。实在没有很好的通用buffer，那么你需要延长酶切时间。
用单酶切不是不可以，但质粒自连的可能性会很大，这种情况下，你可以用
碱性磷酸酶处理后再进行连接，但自连可能性还是有的。
醇沉法就是加入两倍体积的
乙醇，然后在－20或者-70中放置15-30min，接着进行短暂低速离心（1-2Min,5000 rpm左右），弃上清，然后干燥。干燥后加入适当的水或者TE溶解就OK了。醇沉法回收DNA片段效率会很低，所以你要预先多准备一些DNA。