一、实验目的 通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法。 通过薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。 二、实验原理 绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶 黄素（黄）等多种天然色素。 叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C 55 H 72 O 5 N 4 Mg) 和 叶绿素b(C 55 H 7 O 6 N 4 Mg) ，其差别仅是a 中一个甲基被b 中的甲酰 基所取代。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光 合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a 的含量通常是b 的3 倍。 尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于 醚、石油醚等一些非极性的溶剂。 二、实验原理 胡萝卜素(C 40 H 56 )是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体， 即a-, β - 和γ - 胡萝卜素，其中β - 异构体含量最多，也最重要。在生物体 内，β - 体受酶催化氧化即形成维生素A 。目前β - 胡萝卜素已可进行工 业生产，可作为维生素A 使用，也可作为食品工业中的色素。 叶黄素(C 40 H 56 O 2 )是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通 常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚 中溶解度较小。 二、实验原理N N N N Mg CO 2 CH 3 CH 2 O CH H 3 C H 3 C R CH 2 CH 3 CH 3 CH 2 CH 2 C O O CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3叶绿素 a (R=CH 3 )叶绿素 b (R=CHO)二、实验原理CH 3 H 3 C R CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 R H 3 C CH 3 H 3 Cβ-胡萝卜素（R=H） 叶黄素（R=OH）CH 2 OH维生素A三、基本操作与技术薄层色谱 薄层色谱常用TLC表示，又叫薄板层析，是色谱法中的一种，是 快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固-液吸附 色谱，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（几 到几微克，甚至0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸 附层加厚加大，因此，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较 小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的质。此外，薄层色 谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”。 薄层色谱的原理是利用吸附剂（硅胶、氧化铝等）对不同组分吸 附能力的差异从而达到分离目的的方法。 三、基本操作与技术�6�1薄层板的制备 吸附剂：最常用硅胶GF254；硅胶HF254。 粘结剂：一般用所羧甲基纤维素钠（CMC），也有用淀粉的。CMC 配成1％水溶液使用。 制板：以小板的制备为例，将硅胶加1％CMC，调成桨状（在 平 铺玻璃板上能晃动但不能流动），将其涂在载玻片上 （75 ×25），为使其坦平，可将载玻片用手端平晃动，致坦平 为止，放在干净平坦的台面上，晾干之后放入110℃烘箱 活 化1小时即可使用。 三、基本操作与技术�6�1点样 点样用的毛细管为内径＜1mm的管口平整的毛细管，将样品溶于 低沸点的溶剂（乙醚、丙酮、乙醇、四氢呋喃等）配成1％溶液。 点样前，可先用铅笔在小板上距一端5mm处轻轻划一横线，作为 起始线，然后用毛细管吸取样品在起始线上小心点样，如需重复点样， 则应待前次点样的溶剂挥发后方可重点。若在同一块板上点几个样， 样品点间距离为5mm以上。 三、基本操作与技术�6�1展开 展开剂的选择主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因 素来考虑。 薄层的展开在密闭的容器中进行。先将选择的展开剂放入色谱器 中（小板可用广口瓶代替），使色谱器内空气饱和5-10min，再将点好 试样的薄层板放入色谱器中进行展开，点样的位臵必须在展开剂液面 之上，当展开剂上升到薄层的前沿（离前端5-10mm）或多组分已明显 分开时，取出薄层板放平晾干，用铅笔划溶剂前沿的位臵后，即可显 色。 三、基本操作与技术�6�1显色 如果化合物本身有颜色，就可直接观察它的斑点。如果本身无色， 可先在紫外灯光下观察有无荧光斑点（有苯环的物质都有），用铅笔在 薄层板上划出斑点的位臵；对于在紫外灯光下不显色的，可放在含少量 碘蒸气的容器中显色来检查色点（因为许多化合物都能和碘成黄棕色斑 点），显色后，立即用铅笔标出斑点的位臵。�6�1计算比移值 记下原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值（Rf）。 三、基本操作与技术 距离 溶剂前沿至原点中心的 点中心的距离 溶质最高浓度中心至原f R四、主要仪器与试剂仪器:研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶、直形冷凝管、层析缸试剂:硅胶G ，甲醇，石油醚（60-90 ℃），丙酮，乙酸乙酯，菠菜叶 五、实验装臵图 薄层板在层析缸中展开 六、实验流程图 菠菜 菠菜汁 萃取液 研磨 过滤 石油醚-甲醇 萃取 浸膏 水 洗涤、蒸馏 薄层层析R f值 分别用展开剂（a ）石油醚- 丙酮=8:2 （体积比）和（b ） 石油醚- 乙酸乙酯=6:4 （体积比）展开，比较不同展开剂系 统的展开效果。 七、实验关键及注意事项薄层层析时，薄层板的制备要厚薄均匀，表面平整光洁。点样与展开应按要求进行：点样不能戳破薄层板面；展开 时，不要让展开剂前沿上升至底线。否则，无法确定展开 剂上升高度，即无法求得Rf值和准确判断粗产物中各组分 在薄层板上的相对位臵。 八、思考题 在一定的操作条件下为什么可利用Rf值来鉴定化合物？ 在混合物薄层色谱中，如何判定各组分在薄层上的位臵？ 展开剂的高度若超过了点样线，对薄层色谱有何影响？
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