正如中共中央所预料的那样，国民党是不会放弃其反共政策的。于1940年下半年，国民党将反共重心转向华中地区，第二次反共高潮被掀起。7月16日，国民党方面向中共提出所谓“中央提示案”，企图压缩八路军、新四军的编制，限制共产党在敌后发展抗日力量。10月19日，又发出“皓电”，限令八路军、新四军于1个月内，全部开到黄河以北的冀察地区。与此同时，国民党调整军事部署，将包围陕甘宁边区的军队增加到40万之众；密令第3战区部署围歼皖南新四军军部及其所属部队；密令汤恩伯、李品仙等部配合鲁苏战区韩德勤部，准备进攻华中的八路军和新四军。
中共中央面对空前严重的局面，为避免内战，于11月9日复电国民党当局，驳斥了“皓电”的种种诬蔑不实之词，坚决不同意让华中敌后战场的八路军、新四军全部北移的无理要求；同时作出重大让步，决定皖南新四军部队“遵令北移”。但是，国民党方面反而将中共中央的态度视为软弱，竟步步进逼，并于1941年1月悍然发动“皖南事变”，对正在北移的新四军军部及直属部队实行重兵包围攻击。新四军皖南部队9000余人血战七昼夜，面对敌众我寡的形势，除2000余人突出重围外，其余大部壮烈牺牲。军长叶挺被扣，副军长项英遇害。随即蒋介石宣布新四军为“叛军”，下令取消其番号，从而把第二次反共高潮推到了极点。
“皖南事变”后，激起国内外一片舆论，人们为之震惊，视此为国共分裂、内战的开始。然而，中共中央出于维护国家民族利益的考虑，决定：仍以抗日大局为重，坚持又联合又斗争，以斗争求团结的政策，在军事上严守自卫，在政治上坚决反击，团结国内外一切可以团结的力量，把斗争进行得有理。有利、有节。1月20日，中共中央发布重建新四军的命令，号召新四军全体指战员继续坚持大江南北的抗日阵地，坚持团结抗战。同时，通过各种途径向国内和国际社会揭露几年来国民党顽固派制造反共事件的真相，并再次阐明了中国共产党坚持团结抗战的严正立场。
对于中国共产党处理“皖南事变”善后的正确立场和合理主张，国内外进步和中间势力的表示同情和支持，形成了反对国民党顽固派倒行逆施的强大潮流。鉴于政治上的被动和孤立，国民党顽固派不得不收敛其反共行径。3月，蒋介石公开保证不再对中共党进行围剿，对八路军、新四军的北移和编制问题，也采取了含糊其辞的态度。至此，第二次反共高潮终于被击退，中国的抗日民族统一战线渡过了抗战以来最大的一次危机。