一种新的植物细胞凋亡原位检测方法
摘要 介绍一种由动物细胞凋亡ISEL技术衍生的，并与原生质体染色体制片技术相结合的植物细胞凋亡原位检测方法，此方法简单、直观、灵敏度高，避免了假阳性和非特异性信号的出现;可同时从染色体、核以及DNA不同层次对植物细胞凋亡的特征进行原位检测，并可观察它们在凋亡过程中各个时期的特征及动态变化. 用此方法检测了盐胁迫诱导的玉米根尖细胞凋亡，结果表明盐胁迫下的植物细胞确实具有动物细胞凋亡的典型特征.
关键词 染色体制片 ISEL 细胞凋亡 盐胁迫
细胞凋亡(apoptosis)或细胞程序性死亡(programmed cell death)在动物中被公认为是细胞的一种由基因调控的主动死亡方式. 其主要形态特征为细胞核和细胞质凝缩、变形并片段化，染色体断裂、边缘化，凋亡小体形成等. 典型标志是DNA降解成以一定大小为单位的片段，在Klenow酶的催化下，这些片段的3′-粘末端可被核苷酸补平. 如果掺入了标记的核苷酸如Bio-11-dUTP，便可利用相应的检测系统检测出来. 这就是原位末端标记法(in situ end labeling, ISEL). 在现代分子生物学的推动下，参与动物细胞凋亡的基因及其调控规律逐渐被揭晓，细胞凋亡正在取代细胞增殖而成为生命科学最活跃的研究领域之一. 而植物的细胞凋亡研究目前尚处于起步阶段，对其表面上的形态变化特征还没有弄清楚. 虽然有证据初步表明，植物在某些生理、病理或逆境条件下可出现类似动物细胞凋亡的典型特征，但有无细胞皱缩以及凋亡小体的形成目前尚无定论。 因此，植物细胞这种类似动物细胞凋亡的现象还没有被正式定义为“细胞凋亡”，Katsuhara等人称之为“类细胞凋亡(apoptosis-like cell death)”.
研究凋亡的材料主要是从体外培养取得的，细胞壁的存在使得植物细胞的体外培养具有相当大的难度. 并且细胞壁在凋亡过程中始终不会瓦解，因此细胞内的各种变化就很难显示出来. 我们采用了原生质体染色体制片技术，利用纤维素酶和果胶酶消化细胞壁，以消除凋亡特征显示的障碍. ISEL在动物中是一种应用得较成熟的技术，但就我们所知，此技术还没有在植物方面应用的报道. 我们参考植物荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)，对ISEL进行了修改，使其适用于植物体系，对植物细胞凋亡的检测进行了方法性的摸索，并在不同水平上对一定盐浓度处理不同时间的植物细胞凋亡特征进行了观察和分析.
1 材料与方法
(1) 材料. 供试材料为玉米品种遗单6号，种子由中国科学院遗传研究所谷明光教授赠送.
(2) 玉米根尖分生组织细胞凋亡的盐胁迫诱导. 按照Katsuhara等人的方法，玉米种子用双蒸水浸泡1 d，萌发后转移至培养液(4mmol/L KNO3，1mmol/L NaH2PO4，1mmol/L MgSO4，1mmol/L CaCl2，1mg/L柠檬酸铁盐，NaOH调节pH至5.5)中，黑暗条件下培养，待根尖长至2 cm左右时，将实验组转移至高盐溶液(500mmol/L NaCl，1mmol/L CaCl2)中处理0.5～6 h.
(3) 原生质体染色体制片. 分别取对照组和盐胁迫诱导的根尖约2 mm，甲醇∶冰乙酸(3∶1)固定3 h左右，充分水洗后用2%的果胶酶和2%的纤维素酶(SEVRA)等量混合液于28℃下酶解3h左右，火焰干燥法制片。
(4) ISEL标记(in situ end labeling). 参照Gustafson和Dille的原位杂交方法及相应的检测系统，设计了一个新的ISEL标记法。 基本程序为:制片60℃烘烤1h，RNaseA处理1h，梯度乙醇(70%,95%,100%)脱水。30μL dNTP (dATP, dCTP, dGTP等量混合)，10μLBio-11-dUTP，10 μL10×Buffer，2μLKlenow酶(Sigma)加ddH2O至终体积100μL，混匀后对照组和盐胁迫组各加50 μL，于15℃下标记过夜，0.5mol/L Na2EDTA终止液终止5min。
(5) 标记结果的检测和观察. 标记后的制片42℃下用2×SSC溶液，0.1×SSC 溶液中漂洗各15min; 0.1% TritonX-100室温下处理4min； PBS室温下清洗2次，每次5min. 漂洗后，加FITC-羊抗生物素抗体(Sigma)37℃保温30min. PBS漂洗3次，加等量兔抗羊生物素抗体偶联物(Sigma)37℃保温30min. PBS漂洗3次，重复偶联放大2次后，最后1次加FITC-羊抗生物素抗体. PI复染，Olympus BH-2荧光显微镜(日本)观察，照相。
2 结果和分析
对照组和盐处理不同时间(0.5, 1, 2, 6h)的染色体和间期核的标记结果表明，根据Gustafson等人的原位杂交方法设计的ISEL标记效率很高. 在对照组中，可能由于种子萌发过程中某些不良因素如营养不足的影响，造成少量DNA断裂，约20%的染色体和核便有少量的荧光信号出现，且基本上在1条染色体的同一位置出现2个点，表明2条染色单体相同位置的断裂DNA几乎都被标记上，并说明这些位点是特异的内切酶位点，因为只有内切酶才会对DNA进行特异性切割。盐处理0.5h后，所有的染色体和核都出现了分布较均匀的荧光，可清楚地见到每条染色体的2条单体同一位置出现双点，但荧光信号覆盖面积只约10%。而处理1h以上时，DNA断裂密集，因而信号紧密相连，由于荧光边缘效应的存在，看到的是整个染色体或核都成了黄绿色 。从荧光的分布及其变化规律来看，凋亡过程中DNA的断裂是有一定规律的，即先形成较大片段，然后这些大片段再断裂成小片段. 进一步的DNA laddering实验结果也证明了这一点。实验操作过程中必须避免其他DNA酶类的污染。
形态上的变化表明，对照组的染色体和细胞核被PI复染为红色，形态完好，染色体为规则长条形，间期核为规整的圆形；而盐胁迫组情况不同，0.5h时，虽然染色体和核的形态没有任何变化，但DNA已部分断裂 。1 h后，形态变化仍不明显，而DNA严重断裂 。2h时，染色体和核的形态已部分受到破坏，开始出现局部团块，但核仁完好无损、处理6h时，染色体断裂并进一步凝缩，间期核断裂并形成碎片，形态不规整，散在分布，核仁消失。这些标记结果和形态变化与Katsuhara等人在盐处理诱导的大麦根尖分生组织细胞的凋亡研究中的结果一致，也与其他一些条件诱导下的细胞凋亡TUNEL(terminal deoxynucleotidyl trans ferase mediated dUTP nick end_labeling) 检测或DNA laddering检测结果相符。表明各种条件诱导的植物细胞凋亡有着共同特征，DNA ladder的形成几乎是所有细胞凋亡及细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)的分子标记。从对照组可看出，固定、酶解和脱水等处理对染色体和核的形态以及DNA的完整性没有任何影响。
3 讨论
目前对于植物细胞凋亡或PCD的原位检测还主要限于石蜡切片，我们的实验结果(另文报道)和其他报道的结果表明，这种方法应用于此目的有一些缺点. 细胞壁有很强的黄绿色自发荧光，并对FITC有高度吸附力，产生很高的背景和较强的非特异性信号，并且蛋白酶的预处理能不同程度地增强这种非特异性信号；不同的切面会造成不同程度的DNA断裂，出现假阳性信号. 这些都会干扰分析结果；且反映不出真实的凋亡过程动态变化. 此外，标记液不易渗入细胞，效率不高; 实验过程也比较繁琐、费时。本实验结果表明，基于原生质体制片的原位检测技术能克服上述许多缺点. 由于有效地去除了细胞壁、染色体和核都能与标记液充分接触，因此灵敏度高，而且省去了繁琐的石蜡切片程序;有效地避免了假阳性和非特异性信号的出现;可直接对活体进行各种处理，免去了繁琐的细胞培养. 适合于各种逆境、病理条件下的细胞凋亡以及自然发育过程中PCD的检测. 实验结果也直观，可见到凋亡细胞核和染色体变化的各个时期及变化顺序;还可与TUNEL，DNA laddering等相结合，从不同角度检测凋亡细胞染色体和核的形态变化以及DNA的断裂情况。
结果同时证明，植物细胞凋亡过程中染色质和核的形态变化和变化次序以及分子水平上的变化(DNA断裂)都与动物的类似. 即先是DNA断裂，之后染色质局部凝缩成团块，变形、断裂，同时核变形、片段化，而核仁是在核碎片形成之后再消失. 受损的细胞核在核仁消失之前称为变形(deformation)，而在核仁消失之后称为降解(degradation)。 这些结果证实了前人的推想。结合其他研究结果可以看出，动植物细胞的凋亡不仅在形态上有许多共同特点，在生化及生理水平上也类似，且分子机制也可能存在高度的同源，即是由基因控制的一种细胞主动死亡方式. 当这些基因在发育过程中表达，或在细胞受到外界损伤，而这种损伤不足以引起细胞坏死(necrosis)，但又可能引起可遗传的变异时，便触发细胞的凋亡程序。可以认为，虽然不同条件下诱导的植物细胞凋亡存在一定的差异以及它们与动物的细胞凋亡有相当程度的不同，但这些共同之点便可作为植物细胞凋亡定义的内容. 同动物的一样，植物的细胞凋亡也是维持细胞生存和死亡之间平衡的支点。但在我们的实验中并没有看到染色质的边缘化，在盐处理2h左右时，染色体(质)还紧贴在核仁表面或聚集在核仁周围. 这与Eleftheriou等人以小麦根尖为材料研究原生韧皮部筛管细胞分化以及Mittler等人以豌豆根尖为材料研究木质部导管细胞分化过程中的PCD形态特征不同。
对于逆境下植物细胞发生凋亡的生理学意义，认为是根尖细胞为了阻止盐离子进一步进入植物体的其他组织而采取的一种主动自杀方式，或者是DNA主动降解产生核苷酸(有些蛋白质也可能主动降解为氨基酸)以让植物体重新利用或用来修复逆境胁迫所造成的创伤。
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