1.1 试 剂
RPMI1640、胎牛血清购自Gibco公司；Fura?2 AM 购自中国科学院药物所；β?葡聚糖和EGTA购自Sigma公司；其余试剂均为进口分装或国产分析纯。
1.2 细胞培养
小鼠巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院上海生命科学研究院。于37℃，5%CO2湿润环境中培养, 每3天更换1次培养液, 细胞生长汇合成单层细胞时及时传代, 常规培养液为含10%胎牛血清的RPMI1640。
1.3 细胞生长曲线和蛋白质含量的测定
取对数生长期的细胞按3×103 个/孔接种于96孔板(Cellstar),共接种16板。待细胞贴壁后，吸出孔内的培养液和未贴壁的细胞。各给药组分别给予含12.5，25，50，100，200和400 μg/ml β?葡聚糖的培养液200 μl，进行培养。每板上作对照,每个β-葡聚糖浓度作3个平行孔。每天定时取上述培养板2块, 于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况, 然后将其中1块板以中性红比色法检测细胞生长情况,另1板用lowry法测定蛋白质含量。以培养时间(d)为横坐标, 中性红比色法测得的D值和蛋白质含量为纵坐标, 分别绘制细胞生长曲线和蛋白质变化曲线。
1.4 胞内游离钙浓度测定
细胞内游离钙浓度的测定按文献方法进行。
1.5 cAMP浓度测定
于100 ml培养瓶内接种RAW264.7细胞, 待细胞生长接近汇合时给予不同浓度β?葡聚糖刺激, 分别于刺激后1，5和15 min 3个时间点取样。取样时弃培养液, 立即向瓶内加入1 ml 预冷的0.24 mol/L 高氯酸溶液, 用橡皮刮收集细胞,冰浴下超声破碎细胞, 离心取上清, 以KOH中和至pH 6.3左右, 去除沉淀的高氯酸钾, 取上清液冷冻干燥后于-20℃保存备用。cAMP浓度测定按试剂盒(上海中医药大学)说明书进行。
1.6 数据处理
实验结果用±s表示, 以方差分析作统计学处理。 2.1 β-葡聚糖对RAW264.7细胞生长的影响
在相差显微镜下观察, β-葡聚糖对RAW264.7细胞形态无明显影响。对生长曲线和培养液内蛋白质含量的作用均呈双相性。低浓度β-葡聚糖对RAW264.7细胞具有促进作用, 随着β-葡聚糖浓度的逐渐增大, D值也不断升高, 至β-葡聚糖浓度100 μg/ml时达最高峰, 与对照组(不加β-葡聚糖)比较差异有统计学意义(P<0.01), 但β-葡聚糖浓度进一步增高, D值反而下降, 当浓度为400 μg/ml时几乎完全抑制细胞增殖。
2.2 β-葡聚糖对RAW264.7细胞游离钙的影响
加入β-葡聚糖刺激后胞内游离钙迅速上升, 在5 min时反应达高峰, 游离钙上升幅度与β-葡聚糖浓度有关。以EGTA螯合培养环境中钙离子的结果显示，细胞外钙离子存在与否对β-葡聚糖刺激引起的细胞游离钙波动有明显影响。提示升高的游离钙来自细胞外Ca2+的内流。
2.3 β-葡聚糖对RAW264.7细胞内cAMP含量的影响
β-葡聚糖刺激1 min时细胞内cAMP明显增高(P<0.01), 刺激后5～10 min 则cAMP含量开始下降,但仍较基础水平高。 巨噬细胞是机体免疫系统专职吞噬细胞之一,源自血液单核细胞,广泛分布于所有组织中,成为机体抗入侵微生物的第一道防线,在机体抗真菌感染中也起着重要作用。它通过免疫球蛋白受体和补体受体识别并吞噬受调理素作用的微生物;对于未经调理作用的微生物,则通过一组胚系编码的蛋白-模式识别受体(PRRs)迅速识别表达于微生物表面的称作病原相关微生物模式（PAMPs)的保守微生物分子,如主要存在于革兰阴性菌的脂多糖、革兰阳性菌的磷脂酸以及真菌的葡聚糖等 。β-葡聚糖是真菌细胞壁含量最高的多糖, 具有广泛的生物学效用。已有研究表明, β?葡聚糖可促进多种细胞活化。我们注意到微量β-葡聚糖虽可促进RAW264.7细胞增生, 但对细胞结构形态无明显作用。通过对细胞内第二信使传递系统的观察发现,β-葡聚糖可明显增加细胞内游离钙和cAMP。胞内游离钙和cAMP是细胞内重要的信使分子, 介导许多重要的生理功能。通过观察细胞游离钙和cAMP的变化, 可以了解β-葡聚糖信号在靶细胞内的传导机制。
本实验结果表明,β-葡聚糖刺激可在2～5 min内使细胞内游离钙迅速升高, 而且在一定范围内其上升幅度与β-葡聚糖剂量相关。细胞外Ca2+存在与否对β-葡聚糖刺激后胞内游离钙波动有明显影响, 提示胞内游离钙的升高主要来源于细胞外Ca2+的内流而非细胞内钙库的动员。β-葡聚糖使细胞内cAMP浓度升高是否与β-葡聚糖促细胞增生作用有关, 尚有待进一步研究, 但我们的实验结果提示, cAMP含量变化与细胞蛋白合成的量相关。
β-葡聚糖含量最高的食物
绣球菌含有大量β葡聚糖 绣球菌的最大特点是含有大量β葡聚糖。根据日本食品分析中心的分析，每100 g绣球菌含有β-葡聚糖高达43.6g，比灵芝和姬松茸高出3~4倍。可以说，绣球菌所含的β-葡聚糖为菇类之最 。
绣球菌主要分布在国内的吉林省安图、抚松、敦化、靖宇、长白等林区。黑龙江省的带岭、伊春、五营林区和云南省丽江、中甸等林区，以及国外的日本、韩国、美国、加拿大、澳大利亚，但是资源蕴藏量比较稀少。经济用途：此菌可食用，味道较好。还可利用菌丝体进行深层发酵培养。其培养物对小白鼠肉瘤180有抵抗作用。另外产生对某些真菌有抵抗作用的绣球菌素(sparassol)。
青稞β-葡聚糖是青稞籽粒胚乳细胞壁的主要成分，占细胞壁干重的75%左右。经研究发现，具有降血脂、降胆固醇、调节血糖、提高免疫力、抗肿瘤和预防心血管疾病的作用，引起了全世界的关注。
青稞是藏族群众的基本口粮和西藏最大的特殊作物，进入新世纪后，总产稳定在62-63万吨，扣除基本的生活生产需求55万吨，年实际余粮6-8万吨，农牧民人均积压青稞达30公斤左右。由于流畅不通，加工滞后，转化增值困难，增产不增收，富粮穷户比较普遍。2001-2004年全区农牧民人均收入仅1404-1861元，在全国垫底。政府积极推动的安居工程，子女教育及家庭非自产生活生产消费等都要靠国家补贴，生活水平和质量改善极慢。故而，加快农业产业化发展，实现农产品转化增值，进而增加农民收入成为农业生产的基本目标。1,2 人类富贵病上升引起国内外对西藏青稞高β-葡聚糖含量优势的特别青睐。中美两国食药监部报告透漏：二十年来，随着人类生活水平的提高，青少年肥胖症普遍增加1-2倍，引致各类慢性病发病率提高50%以上，心，脑血管疾病成为人类死亡率最高的第一大疾病。我国高血压发病率达到18.8%，血脂异常人群超过2亿，诊断糖尿病患者达到4000多万人。WHO.FAO专家一致认为：动物类食品比重提高，肉类摄入过多，营养过剩特别是胆固醇，脂肪，糖分等摄入积累过量，果蔬摄入量低，维生素，纤维素，钙，铁质严重不足，是导致上述疾病高发的关键因素。高蛋白，高纤维，高维生素，高矿物和低脂肪，低胆固醇，低糖，低纳的“四高四低”食品概念也就应该应运而生了，富含β-葡聚糖等膳食纤维成分的燕麦，大麦及其青稞食品受到特别青睐。美，法等国食药监局不但允许在大麦和含大麦的产品包装上标明该类食物能减少患冠心病的风险，还强制规定“一般成人日均摄入食品中的β-葡聚糖绝对不低于3克”的指标。
上世纪九十年代初期，美国，加拿大，澳大利亚，瑞典等过科学家以及国内浙江大学，天津商学院，天津军事医学科学院的学者研究证实：1,燕麦和大麦中的β-葡聚糖具有突出的降血脂，调剂血糖，清肠毒和提高免疫力及防癌等生理功效；2，中国西藏高原及其周边区域种植的裸大麦即青稞品种的β-葡聚糖含量普遍高于世界其它地区种植的大麦品种。基于以上理由，我们从西藏青稞品种β-葡聚糖含量普查筛选入手，逐步开展了青稞β-葡聚糖的生理功效，提前与利用技术等系统实验研究，以为发展青藏高原的特色青稞加工提供技术支撑，对促进该区域农产品的发展给以帮助支持。
