为什么篮斑做PCR菌液鉴定也能P出来条带呢

Question

我用蓝白斑做的 T载体和目的片段连，为什么篮斑的 做PCR菌液鉴定也能P出来条带呢？

Answer 1

1 如果你用了目的片断特异的引物，那么可能是你连接时加的目的片断过多，菌表面粘附了目的片段（我曾经在没有斑的地方蘸一下，也能P出目的带），这样验证阳性克隆时建议你
1〉用T-vector两端的测序引物（如M13F+R），做个PCR，看能否扩出目的大小的带，如果有，说明肯定有片断连入T载体；如果能用一个测序引物和一个你自己的引物扩增就更好了，不但可以确定插入的方向还可以肯定是你的片断插入。
2〉如果你没有这些引物，可以抽出质粒后，用你的特异引物，进行较少循环数的扩增，如果能拿到很亮的带，那么很可能是阳性；因为提质粒后蘸附的片断会很少，而质粒作模板有利于目的基因的克隆；当然你也可以酶切验证。

2 有些片断较短，插入后并没有导致LacZ的移码，仍然会显出蓝色，所以有时蓝色不一定 ，没有目的片断插入，特别是当满板都是淡蓝时。

Answer 2

假阴性。我们分子考过的。

蓝斑中，可能插入了片段，插入的片段可能只是是目的片段的一小部分（被核酸酶不小心降解了），但由于插入的片段size很小，而且恰巧与lacZ基因的开放阅读框ORF(open reading frame)一样的话，就可能产生拥有部分活性的β-半乳糖苷酶β-lacZ，从而出现蓝斑。

False negative , that is, blue colonies with very short inserts. The inserted fragment is part of the whole insert, which may be degraded by nuclease into small inserts. Because the insert is too small, and it may use the same ORF as the origin LacZ, the result is a partly active enzyme which results in blue colonies.