（1）具互补黏性末端片段之间的连接：连接反应可用emphasis：role=italicE.coliemphasis：DNA连接酶，也可用T4：DNA连接酶。待连接的两个DNA片段的末端如果是用同一种限制性内切核酸酶酶切的，连接后仍保留原限制性内切核酸酶的识别序列。如果是用两种同尾酶酶切的，虽然产生相同的互补黏性末端，可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子往往消失了原来用于酶切的那两种限制性内切核酸酶的识别序列。
（2）具平末端DNA片段之间的连接：连接反应必须用T4：DNA连接酶。只要两个DNA片段的末端是平末端的，不管是用什么限制性内切核酸酶酶切后产生的，还是用其他方法产生的，都同样可以进行连接。如果用两种不同限制性内切核酸酶酶切后产生的平末端DNA片段之间进行连接，连接后的DNA分子失去了那两种限制性内切核酸酶的识别序列。如果两个DNA片段的末端是用同一种限制性内切核酸酶酶切后产生的，连接后的DNA分子仍保留那种酶的识别序列，有的还出现另一种新的限制性内切核酸酶识别序列。
（3）DNA片段末端修饰后进行连接：待连接的两个DNA片段经过不同限制性内切核酸酶酶切后，产生的末端未必是互补黏性末端，或者未必都是平末端，因此无法进行连接。在这种情况下，连接之前必须对两个末端或一个末端进行修饰。修饰的方式主要是采用核酸外切酶Ⅶ（exonuclease：Ⅶ，Exo：Ⅶ）将黏性末端修饰成平末端；采用末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）将平末端修饰成互补黏性末端。有时为了避免待连接的两个DNA片段自行连接成环形DNA，或自行连接成二聚体或多聚体，可采用碱性膦酸酯酶将其中一种DNA片段5′-P修饰成-OH。
（4）DNA片段加连杆后连接：如果要连接既不具互补黏性末端又不具平末端的两种DNA片段，除了上述用修饰一种或两种DNA片段末端后进行连接的方法外，还可以采用人工合成的连杆（linker）或衔接头（adaptor）。先将连杆连接到待连接的一种或两种DNA片段的末端，然后用合适的限制性内切核酸酶酶切连杆，使待连接的两种DNA片段具互补黏性末端，最后在DNA连接酶催化下使两种DNA片段连接，产生重组DNA分子。此外，也可以根据两DNA片段的末端，选用合适的衔接头直接把两DNA片段连接在一起。