1ã
æ¯æ°é
µæ¯
æ°¯åé转åæ³
(1)è¯å 1M LiCl(ç¨å»ç¦»å
è¸é¦æ°´é
å¶ï¼æ»¤èè¿æ»¤é¤è;å¿
è¦æ¶ç¨æ¶æ¯
å»ç¦»åæ°´ç¨é) 50% PEG3350(Sigma P3640 ç¨å»ç¦»åè¸é¦æ°´é
å¶ï¼æ»¤èè¿æ»¤é¤èï¼ç¨è¾ç´§ççåçç¶ååè£
) 2mg/ml salmon sperm DNA / TE(10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA)-20âä¿å 注ï¼éé
¸é对æ¯æ°é
µæ¯æ æï¼ä»
æ°¯åéææ;PEG3350å¯å±è½é«æµåº¦LiClçæ¯å®³ä½ç¨;
(2)æåææ¯æ°é
µæ¯çå¶å¤ æ¥ç§Pachia pastoriså°50ml YPDå¹å
»åºä¸ï¼30âæèè¿å¤(约24ï½28h)å¹å
»å°
ODå¼ä¸º0.8ï½1.0(约108 Cells/ml); æ¶è·ç»èï¼ç¨25mlæ èæ°´æ´æ¶¤ä¸æ¬¡ï¼å®¤æ¸©ä¸1500g离å¿10min; éæ¬ç»èäº1ml 100mM LiCl溶液ä¸ï¼å°æ¬æ¶²è½¬å
¥1.5ml离å¿ç®¡;
离å¿æºæ大é度离å¿15ç§æ²æ·èä½ï¼éæ¬èä½äº400ul 100mM LiCl溶液ä¸; æ50ul/管åè£
ï¼ç«å³è¿è¡è½¬å; 注ï¼ä¸è¦å°æåæ
é
µæ¯èå°æµ´;
(3)æ¯æ°é
µæ¯ç转å ç
®æ²¸1mlé²é±¼ç²¾DNA 5minï¼è¿
éå°æµ´ä»¥å¶å¤åé¾æ
ä½DNA; å°æåæé
µæ¯è离å¿ï¼ä»¥Tipså»é¤æ®ä½çLiCl溶液; 对äºæ¯ä¸ä¸ªè½¬åï¼æ以ä¸é¡ºåºå å
¥ï¼ 50% PEG3350 240ul 1M LiCl 36ul 2mg/ml åé¾Salmon sperm DNA 25ul 5ï½10ug/50ul H2O è´¨ç²DNA 50ul å§çæ涡混åç´è³æ²æ·èä½å®å
¨åå¸åå(约1min); 30âæ°´æµ´åµè²30min; 42âæ°´æµ´çä¼å
20ï½25min; 6000ï½8000rpm离å¿æ¶éé
µæ¯èä½; éæ¬é
µæ¯äº1ml YPDå¹å
»åºï¼30âæåºåµè²; 1ï½4håï¼å25ï½100ulè液éºéæ©æ§å¹å
»åºå¹³æ¿ï¼äº30âå¹å
»2ï½3天é´å®;
2ãæ¯æ°é
µæ¯PEG1000转åæ³
(1)è¯å
ç¼å²æ¶²Aï¼1.0M Sorbitolï¼10mM Bicineï¼pH8.35(sigma),3%(v/v)ethylene glycol ç¼å²æ¶²Bï¼40%(w/v)PEG1000(sigma)ï¼0.2M Bicineï¼pH8.35 ç¼å²æ¶²Cï¼0.15M NaClï¼10mM Bicineï¼pH8.35 æªæ±¡æçæ°é²ãè¯å级DMSOï¼-70âä¿å æ³¨ï¼ ç¼å²æ¶²AãBãCåç¨æ»¤èè¿æ»¤ï¼-20âä¿å; å°DNAç´æ¥å å¨å»ç»çé
µæ¯ç»èä¸æ¯æ¬å®éªçå
³é®ä¹å¤(å³ä½¿å¨å°ä¸è§£å»çå¾
转åç»èï¼å
¶æåå¤æºDNAçè½åä¹å¨è§£å»è¿ç¨ä¸è¿
éä¸é;å¦è¿è¡å¤æ ·åç转åï¼å»ºè®®æ6æ ·å/ç»è¿è¡);
(2)å¾
转åæ¯æ°é
µæ¯çå¶å¤ æ¥ç§ç¯æ¥ç§Pachia pastorisäºYPDå¹³æ¿ï¼30âå¹å
»2d; æååå
éé
µæ¯èæ ªäº10mlYPDå¹å
»åºä¸ï¼30âæ¯è¡å¹å
»è¿å¤; åæ¥éª¤2ä¸å°éè液æ¥ç§å°100mlYPDå¹å
»åºä¸æ¯è¡å¹å
»ï¼å¾
å
¶ODå¼ä»0.1åå°0.5ï½0.8; 室温ä¸3000g离å¿æ¶éé
µæ¯èä½ï¼50mlç¼å²æ¶²Aæ´æ¶¤ä¸æ¬¡; éæ¬èä½äº4mlç¼å²æ¶²Aä¸ï¼æ0.2ml/管åè£
äº1.5mlç离å¿ç®¡ä¸ï¼æ¯ç®¡å å
¥11ulDMSOï¼æ··ååè¿
éäºæ¶²æ°®ä¸å·å»ï¼ -70âä¿å
(3)æ¯æ°é
µæ¯ç转å å°çº¦50ug线æ§åè´¨ç²DNA溶äº20ul TEææ°´ä¸ï¼ç´æ¥å äºå»ç»çé
µæ¯ç»èä¸;å å
¥æ
ä½DNA(40ugåæ§è¶
声线æ§åé²é±¼ç²¾DNA)以è·å¾æ大
转åç; 37âæ°´æµ´åµè²5minï¼ä¸é´æ··åæ ·å1ï½2次; ååºç¦»å¿ç®¡ï¼å å
¥1.5mlç¼å²æ¶²Bï¼å½»åºæ··å; 30âæ°´æµ´åµè²1h; 室温ä¸2000g离å¿10minï¼å»é¤ä¸æ¸
液ï¼èä½æ²æ·éæ¬äº1.5mlç¼å²æ¶²Cä¸; 离å¿æ ·åï¼å»é¤ä¸æ¸
液ï¼è½»å¾®æä½å°æ ·åéæ¬äº0.2mlç¼å²æ¶²Cä¸; å°ææ转å液éºäºéæ©æ§å¹³æ¿ï¼äº30âåµè²3ï½4天åï¼é´å®;
3ãæ¯æ°é
µæ¯çµè½¬åæ³
(1)
E.coli TOP10Fâ
æåæç»èçå¶å¤ å10ul TOP10Fâè液ï¼æ¥ç§äº200ml LB液ä½å¹å
»åºä¸æ´»åå¹å
»ï¼37âï¼200 rpmï¼16ï½18å°æ¶ãå100ulè液æ¥ç§äº200ml液ä½
LBå¹å
»åºä¸ã 37âï¼200 rpmï¼å¹å
»16ï½18å°æ¶ã çè500 ml离å¿ç®¡ï¼4âï¼4000 rpmï¼20 minãå¾èä½æ²æ·ãå¼ä¸æ¸
ï¼èä½ç¨10%çæ²¹éæ¬å¹¶æ´æ¶¤ãéå¤æ´æ¶¤3次ã 第ä¸æ¬¡ç¦»å¿åï¼å¼ç»å¤§é¨åä¸æ¸
ï¼çä¸çº¦1ml 液ä½ç¨äºéæ¬èä½ã ä»å¶å¾å¾æåæç»èä¸ï¼å200uläºçèEP管ä¸ï¼å å
¥è¿æ¥ååºäº§ç©5ulï¼æ··åï¼ä¸è¦äº§çæ°æ³¡ï¼å¨å°ä¸æ¾ç½®5minã å°æ··ååå¾200ulè液移å
¥çµå»æ¯ä¸ã 使ç¨çµå»ç©¿å仪è¿è¡è½¬åï¼è®¾ç½®ä¸ºçµå 2500 Vï¼æ¶é´ 5 msã çµå»åï¼å¾çµå»æ¯ä¸å å
¥ 800ul SOCå¹å
»åºï¼å²æ´åºèä½ï¼è½¬ç§»è³çè1.5 ml EP管ä¸ã37âï¼150 rpm ï¼è½»æ45ï½60 minã åå
¨é¨ååæ¶å¸äºå« Zeocin 25 ug/ml çLLB-Zeocinå¹³æ¿ä¸ï¼æ£æ¾ï¼å¾
æ¶å¸æ¶²ä¸å¨æµå¨ï¼37â å¹å
»12ï½16å°æ¶ã
(2)线æ§åè´¨ç²DNA对Pichia pastorisGS115ç转å åæ°é²å¶å¤ç(æ-70âå»åç)æåæç»èç½®äºå°æµ´ä¸ï¼ä½¿å
¶å®å
¨è§£å»;
1)å°100μlèä½ç§»åºè³ä¸æ°çæ èEppendorf管ä¸ï¼å å
¥5-20μg线æ§åè´¨ç²(5ï½10μl)ï¼è½»å¼¹æ··åï¼å°½æ°å¸åºè½¬ç§»å°0.2cmåççµç©¿å转åæ¯ä¸;
2) 转åæ¯ç½®äºå°æµ´ä¸5ï½10åéï¼ä¿æä½æ¸©ã
3) çµç©¿å转åçµå»æ¡ä»¶ï¼çµåï¼1500V;çµé»ï¼400Ω;çµå®¹ï¼25μF;èå²æ¶é´ï¼10mS;ä¸æ¬¡çµå»ã
4) çµå»åï¼é©¬ä¸å¨çµå»è½¬åæ¯ä¸å å
¥1ml 4âé¢å·ç1Mç
山梨é溶液ï¼ç¨å¾®é
移液æªå¹æååï¼ç½®äºå°æµ´ä¸; 5) å30âçè³è¡¨é¢åå¹²çMDå¹å
»åºå¹³æ¿ï¼å¨è¶
åå·¥ä½å°ä¸æ èæä½æ¶å¸å¹³æ¿ï¼400μl/æ¿