构建基因文库是获取目的基因的方法之一．图甲表示cDNA（互补DNA）文库构建过程，其中①～③表示有关操作

Question

构建基因文库是获取目的基因的方法之一．图甲表示cDNA（互补DNA）文库构建过程，其中①～③表示有关操作步骤．图乙表示用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和SalⅠ单独或联合切割图甲中的质粒DNA分子，经凝胶电泳分离后所得到的图谱．请据图回答下列有关问题：（1）设计引物是cDNA（互补DNA）文库构建过程的第一步，引物长度一般在15-30个碱基之间，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应．若引物过短则存在______等问题．（2）图甲过程②、③分别需要在______、______酶的作用下形成cDNA的第一条链、第二条链，这两个过程都需要利用______作为原料．（3）在⑤和⑦过程中cDNA和质粒DNA的3’端都要各加上一段寡聚核苷酸（20个以下碱基的核苷酸短链），制成______；过程⑧在DNA连接酶的作用下，形成重组DNA．图示这种情况下能形成______种重组DNA，理由是______．（4）请根据图乙电泳图谱分析各限制酶的酶切位点，并在答题纸的质粒上标出各个限制酶的酶切位点和各位点间的大小．

Answer 1

（1）PCR扩增DNA时要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物，引物不能过短，否则没有一定的特异性，容易导致配对错误．
（2）图甲中②过程是以mRNA为模板合成DNA链过程，该过程需要逆转录酶，过程③是以DNA一条链为模板合成双链DNA过程，需要DNA聚合酶．两个过程都是合成DNA链，所以需要四种脱氧核苷酸作原料．
（3）由图可知，在cDNA和质粒DNA上加上一段寡聚核苷酸的目的是形成黏性末端，由于加上的核苷酸种类相同，所以不存在自身环化或同种DNA两两结合的现象，只能形成1种重组DNA分子．
（4）由PstⅠ酶切结果可知，质粒的长度为4.36kb，PstⅠ和EcoRⅠ切割形成3.61kb和0.75kb，PstⅠ和SalⅠ切割形成3.23kb和1.13kb，所以PstⅠ与EcoRⅠ的距离为0.75kb，EcoRⅠ与SalⅠ的距离为0.38kb，SalⅠ和PstⅠ的距离为3.61kb．
故答案为：
（1）没有一定的特异性，容易导致错配（或影响退火温度）  
（2）逆转录酶  DNA聚合酶    游离的脱氧核苷酸
（3）黏性末端    1（或2）同一种DNA的两端的尾巴是相同的，不存在自身环化或同种DNA两两结合的现象
（4）如下图