ããåºå å
éåéè¦å¨çèå
éªè¯åè½
ããåºå çå
éå°±æ¯å©ç¨ä½å¤éç»ææ¯,å°ç¹å®çåºå åå
¶å®DNA顺åºæå
¥å°è½½ä½ååä¸ãåºå å
éç主è¦ç®æ æ¯è¯å«ãå离ç¹å¼åºå 并è·å¾åºå çå®æ´ç å
¨åºå,ç¡®å®æè²ä½å®ä½,éæåºå ççååè½,æç¡®å
¶å¯¹ç¹å®æ§ç¶çéä¼ æ§å¶å
³ç³»ãéè¿å åå¹´çåªåç±äºæ¤ç©åè²,çççå,ååéä¼ çå¦ç§çè¿
éåå±,使 人们ææ¡äºå¤§éæå
³æ¤ç©ä¼è¯æ§ç¶åºå ççç©å¦åéä¼ å¦ç¥è¯,åè¿ç¨å
è¿çé
¶å¦åçç©å¦ææ¯å·²ç»å
éåºäºä¸æ¤ç©æç
ãæè«ãæé¤èåãæé,è²æ§ãé«èç½è´¨ åä¸æ¤ç©åè²æå
³ç许å¤åºå ãæ们å®éªå®¤å¯¹å¤©éº»æçèèç½åºå ä½äºåè½å
éçç 究(è群è³ç,1995;è群è³ç,1997),为äºå
éæ¤ç©åºå ä¹æ¢è®¨äº å
¶å®å
éæ¹æ³,æ¬æ论述åºå å
éççç¥ãæ¹æ³ååå¾çä¸äºè¿å±ã
ãã1ãåè½å
é(functional Cloning)
ããåè½å
éå°±æ¯æ ¹æ®æ§ç¶çåºæ¬çåç¹æ§è¿ä¸åè½ä¿¡æ¯,å¨é´å®åå·²ç¥åºå çåè½åå
é(Collis,1995)ãå
¶å
·ä½ä½æ³æ¯:å¨çº¯åç¸åºçç¼ç èç½åæ建 cDNAæåºæåºå ç»æåº,DNAæåºä¸åºå ççéæ ¹æ®æ
åµä¸»è¦å¯ç¨äºç§åæ³è¿è¡,(1)å°çº¯åçèç½è´¨è¿è¡æ°¨åºé
¸æµåº,æ®æ¤åæå¯¡æ ¸è·é
¸æ¢éä»cDNA åºæåºå ç»æåºä¸çéç¼ç åºå ,(2)å°ç¸åºçç¼ç èç½å¶æç¸åºæä½æ¢é,ä»cDNAå
¥è½½ä½è¡¨è¾¾åºä¸çéç¸åºå
éãåè½å
éæ¯ä¸ç§ç»å
¸çåºå å
éçç¥,å¾ å¤åºå çå离å©ç¨è¿ç§çç¥ã
ããHainçä»è¡èä¸å
éäºä¸¤ä¸ªç¼ç ç½èè¦éåæçäºè¯ä¹ç¯åæé
¶åºå (Vst1åVst2),è¡èä¸æèåå ç©ç½èè¦éçåå¨,å¯ä»¥æé«å¯¹ç°è´¨è¡èå¢(Botrytis cinerce)çææ§,å¨çèåå
¶å®ä¸äºæ¤ç©ä¸æ äºè¯ä¹ç¯åæé
¶,å æ¤å
é该åºå ç»è¿è½¬åºå å,对æäºæ¤ç©äº§ç对ç°è´¨è¡èå¢çææ§å¾ææä¹(Hain ç,1985)ãKondoç1989年对ç¼ç 水稻巯åºèç½é
¶æå¶åçåºå ç»DNAåäºå
éååºååæ(Kondoç,1989)ãå¨å
æçæ建äºæ°´ç¨» cDNAæåº,å离äºç¼ç 水稻巯åºèç½é
¶æå¶åçcDNA(å¨å
æç,1996)ãæ¤ç©èç½é
¶æå¶åæ¯ä¸ç±»å¤©ç¶çæè«ç©è´¨,å®å¯æå¶æé£å®³è«å¯¹èç½è´¨çæ¶ å,使害è«å 缺ä¹æéæ°¨åºé
¸è导è´éæ£å¸¸åè²ææ»äº¡ãè¡å¤©åç人ä»çèä¸å离åºæµè¡äºæå½çé»çè±å¶ç
æ¯(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并å
éäºç¼ç 该ç
æ¯å¤å£³èç½çcDNAåºå (è¡å¤©åç,1989)ãçæ¥é¦çä»æç
ççèå¶çä¸å离纯åäºé©¬éè¯xç
æ¯ (potato virus X, pvx),å
éäºå®æ´ç马éè¯xç
æ¯å¤å£³èç½åºå ,并å°å¤å£³èç½åºå 转å
¥é©¬éè¯ä¸,以æè·å¾æpvxç
æ¯çæ ½å¹ç§é©¬éè¯(çæ¥é¦ç,1991)ãç
æ¯å¤å£³ èç½(Coat protein cp)åºå çæåå
é,å¯ä½¿è½¬åºå æ¤ç©ä¸äº§çç
æ¯å¤å£³èç½åºå ä»å¯¼çææ§(Coat Protein Mediated Resistance CPMR)æç
æ¯CP-RNAä»å¯¼çææ§ãVan kan æ¥éä»çèä¸æåçå
éåºæ æ¯åºå Avr9,å¯ç´æ¥å©ç¨æ¤åºå ä»å¯¼å¹¿è°±é«æçåºå å·¥ç¨æ¤ç©(Van Kanç,1991)ãæ们1995å¹´æ建äºå¤©éº»cDNAæåº,å¶å¤æä½æ¢éæåå°å离äºç¼ç 天麻æçèèç½åºå çcDNAå
é,为æçèåºå å¨åä¸ãå» è¯çæ¹é¢çåºç¨æä¸äºåºç¡(è群è³ç,1995;è群è³ç,1997)ãåè½å
éçç¹ç¹æ¯ç¨åºå 表达ç产ç©èç½è´¨æ¥å
éåºå ãè½ç¶æä¸æ§ç¶çç¼ç åºå æ¯æª ç¥çãå¦æ对å
¶çççåå代谢éå¾ç 究çæ¯è¾æ¸
æ¥,å°±å¯ä»¥å离å纯åæ§å¶è¯¥æ§ç¶çèç½è´¨ãå æ¤åè½å
éçå
³é®æ¯å离åºä¸ä¸ªçº¯åº¦å¾é«çèç½è´¨ãåªè¦æä¸ä¸ªçº¯ çèç½è´¨,å¾å°ååç¹å¼çæ¢é,è¿ä¸çç¥æ¯è¡ä¹ææçãéç¨åè½å
éæ¹æ³è½ç¶å·²ç»å
éäºå¾å¤åºå ,ä½ç±äºç»å¤§å¤æ°åºå ç产ç©ç®åè¿ä¸ç¥éãæ以大å¤æ°åºå é¾ä»¥ç¨è¿ä¸ç»å
¸çæ¹æ³æ¥å
éãéçååçç©å¦ææ¯çåå±,ä¸æ¡æ°çåºå å
éçç¥éæ¸å½¢æ,è¿å°±æ¯å®ä½å
éã
ãã2ãå®ä½å
é(Positional cloning)
ããæ ¹æ®éä¼ è¿éåæ,æè²ä½æ¥ç§»å°åºå å®ä½å°æè²ä½çä¸ä¸ªå
·ä½ä½ç½®ä¸åä¸æ缩å°çéåºåè¿èå
é该åºå ,ç 究该åºå çåè½æææ§ççåæºå¶,è¿æ ·ä¸ç§çç¥ å«å®ä½å
é(Monaco,1994)ãè¿éåæå³éè¿åºå ä¸DNAæ è®°ä¹é´çéç»ç³»æ°æ¥ä¼°è®¡è¿ä¸¤è
ä¹é´çè·ç¦»,è¥æç§æ§ç¶çåºå ä¸DNAæ è®°å¨å代ä¸å 离,å³æè¿éå¨ä¸èµ·çè¶å¿ãæ ¹æ®è¿ä¸åçå¯å°ä¸å·²ç¥çæä¸DNAæ è®°è¿éçåºå å¨æè²ä½ä¸å®ä½ãç±äºè¿éåæéè¦ä¾èµç¹å®çåºå ä½ä¸ºè¿éæ è®°,å³æ è®°åºå ä¸å¾
ç åºå ä¹é´åå¨è¿éå
³ç³»,è满足ä¸å¾
ç åºå ç¸è¿éçåºå å®å¨å¤ªå°,æ以è¿éåæ对å
é大å¤æ°åºå åå¨çä¸å®çå°é¾ãRFLPçåºç°ä½¿å¤ææ§åºå æ è®°å å¨äºæ´ä¸ªåºå ç»å
,解å³äºè¿éåæä¸é¾ä»¥å
æçå°é¾ã
ãã1980å¹´Wymançç§å¦å®¶é¦æ¬¡å»ºç«äºéå¶é
¶åç段é¿åº¦å¤ææ§RFLP (restriction fragment length polymorphism),使对任ä½ä¸ç§è¡¨åç¸å
³çåºå çå®ä½æ为å¯è½ãéå¶é
¶åç段é¿åº¦å¤ææ§æ¯ç¨éå¶æ§å
åé
¶åå²å产ççDNAç段é¿åº¦çå¤ææ§å åå¾·å°å¼éä¼ ,æ¯åå¨äºå
¨åºå ç»çç¬ç¹çå¤ææ è®°,RFLP使åºå å®ä½åå¾æè¡(Wymanç,1980)ãç®åå®ä½å
éä¸è¬æ¯ç¨RFLPçååæ è®°å¶ä½ éä¼ å¾è°±,寻æ¾ä¸å¾
æµåºå è¿éçRFLPæ è®°,è·å¾åºå å¨æè²ä½ä¸çå®ä½ç¶åå
éåºå ãæ以RFLPååæ¥åå±èµ·æ¥çRAPDææ¯ç建ç«,å¯å°å¾
æµåºå ç¸ å¯¹åç¡®å°å®ä½,å©ç¨å·²ç¥çåºå å¯å离ä¸ä¹è¿éçæªç¥åºå ãå
¶åºæ¬ç¨åºæ¯æ建ä¸ä¸ªåºå ç»æåºãç¨å·²ç¥çAåºå 为æ¢é,ä»åºå ç»æåºä¸çéåºä¸å
¶æåæºåºåç aå
é,åç¨aå
é为æ¢éä»åºå ç»æåºä¸çéåºä¸aå
éæåæºåºåçbå
é,ç¶å以æ¤ç±»æ¨æåçéåºæªç¥åºå 并æå®å离åºæ¥ãç®åå·²å¨çªèãçèã大麦ã 水稻ã大è±ãçç±³çæ¤ç©ä¸åç°äºä¸æç
åºå ç´§å¯è¿éçRFLPæ 记并æ建äºéä¼ å¾è°±(Figdoreç,1988;Heunç,1991;Smith, 1991;Diersç,1992)ãç¨è¿ç§æ¹æ³å·²åå«å
éå°æåè¥èãçªèã水稻çæ¤ç©ä¸çæå
³æç
åºå (Martinç,1993;Bentç, 1994;Mindrinosç,1994;Wenyuanç,1995) ãMartinç1993å¹´ææ©ç¨å®ä½å
éææ¯å
éåºçªèptoåºå ,ptoåºå è´è´£å¯¹å¸¦ææ æ¯åºå Avrptoçç»è,ä¸é¦ååèè (pseudomonas syringae pv)èæ ªçææ§,Ptoåºå 导å
¥æç
çªèå转åºå æ¤æ ªå¢å¼ºäºå¯¹ç
åèçææ§(Martinç,1993)ãWenyuanç1995å¹´ç¨è¿ä¸ææ¯å
éäº æ°´ç¨»Xa21åºå ,Xa21åºå 对çèXanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo)å
·æææ§(Wenyuanç,1995)ã
ãã3ã转座åæ è®°æ³(transposon tagging)
ãã转座åæ¯å¯ä» ä¸ä¸ªåºå ä½ç½®è½¬ç§»å°å¦ä¸ä½ç½®çDNAç段ãå¨è½¬åº§è¿ç¨ä¸åæ¥ä½ç½®çDNAç段(转座å)并æªæ¶å¤±,åç转移çåªæ¯è½¬åº§åçæ·è´ãåºå åç转座å¯å¼èµ·æå
¥çª å使æå
¥ä½ç½®çåºå 失活并诱导产ççªååæå¨æå
¥ä½ç½®ä¸åºç°æ°çç¼ç åºå ãéè¿è½¬åº§åä¸çæ è®°åºå (å¦æè¯æ§ç)å°±å¯æ£æµåºçªååºå çä½ç½®åå
éåºçªååº å æ¥ã转座åæ è®°æ³æ¯æ转座åä½ä¸ºåºå å®ä½çæ è®°åéè¿è½¬åº§åå¨æè²ä½ä¸çæå
¥ååµåæ¥å
éåºå (Fedoroffç,1984;Jonesç, 1994)ã
ããå©ç¨è½¬åº§åå
éæ¤ç©åºå çæä½æ¥éª¤ä¸»è¦åºæ¯ä»¥ä¸å æ¹é¢:(1) æå·²å离å¾å°ç转座åä¸éæ©æ è®°æ建æå«è½¬åº§åçè´¨ç²è½½ä½ã(2) æ转座å导å
¥ç®æ æ¤ç©ã(3) å©ç¨Southernæ交çææ¯æ£æµè½¬åº§åæ¯å¦ä»è½½ä½è´¨ç²ä¸è½¬åº§å°ç®æ æ¤ç©åºå ç»ä¸,è¿æ¯è½¬åº§åå®ä½åå离ç®æ åºå æä¸å¯ç¼ºå°çã(4) 转座åæå
¥çªåçé´å®åå
¶å离(Ellisç,1992)ãé常ç¨äºå
éæ¤ç©åºå ç转座åæçç±³çAc. Mu, SmpåDsçãAcå«æç¼ç 转座é
¶çåºå ,è½å¤èªä¸»ç转座,Dsä¸å«è½¬åº§é
¶æ以ä¸è½èªä¸»ç转座,ä½Ds-Acç³»ç»å Ac为Dsæä¾äºè½¬åº§é
¶å°±å¯ä»¥èªä¸»ç 转座äºãç¨è½¬åº§åæ è®°æ³è¿è¡æ¤ç©åºå çå离,é¦è¦çæ¯æAcç转座å转åå°è¦è¿è¡åºå å
éçæ¤ç©ä¸,ç®åå¤æ°æ¯å©ç¨å壤åæèä»å¯¼ç转åç³»ç»æ转座å导å
¥ ç®æ æ¤ç©ä¸(Kellerç,1993;Bancroftç,1993)ãç®åå·²å¨çç±³ãçèãçªèãäºéº»çæ¤ç©ä¸å
éåºææ§åºå (Johalå Briggs,1992;Whithamç,1994;Jonesç,1994;Gregoryç,1995)ãJohalåBriggeå离åºæç°è²é¿ è å¢(Helminth osporium carbonum)1å·å°ç§çç±³çHMIç¹å¼çèææ§åºå ã该åºå åå¨äºçç±³çææ§åç§ä¸,è½å¤å解é¿è å¢1å·å°ç§äº§çç对çç±³å
·ç¹å¼è´ç
æ§çHCæ¯ç´ , 该åºå ç¼ç HCæ¯ç´ è±æ¯é
¶å¯ä½¿æ¤ç©å
·ææç
æ§(JohalåBriggs,1992)ãå转座åæ è®°æ³çåçç¸ä¼¼çè¿æT-DNAæ è®°æ³,两è
é½æ¯ç±äºä¸ 段åºå çæå
¥å¯¼è´æè²ä½ç»æåçåå产ççªåä½,èT-DNAæ è®°æ³äº§çççªåæ¯ç±äºT-DNAæå
¥å¯¼è´çãKennethçå©ç¨T-DNAæå
¥æ è®°å¹è² åºæåè¥ç®åçªåä½(Kennethç,1989)ã
ãã4ã人工åæ并å
éåºå
ããèèæ¯ç´ æ¯ä¸ç§å°è½,å®åªæ37个氨åºé
¸,ä½å¤å® éªè¡¨æå®è½ææ»å¤ç§å¯¹åä½ç©æ害çæè«,è红ç1995å¹´æ ¹æ®èèæ¯ç´ çæ°¨åºé
¸åºå,éç¨æ¤ç©åç±å¯ç åã人工åæ并å
éäºæ¤è½çåºå (è红ç, 1995)ãAdang 1995年人工åæäºèäºéæèæ¯èç½(Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein)åºå (Adangç,1995)ã
ãã5ã表åå
é(phenotype cloning)
ãã1995å¹´JonssonåWeissmanæåºè¡¨åå
éæ¦å¿µ(JonssonåWeissman,1995),æäºæ¤ç©ç®åå³ä¸äºè§£å®çåºå 产ç©,ä¹æ²¡ æ对å®ä»¬è¿è¡åºå å®ä½,ä½å·²ç¥æ¤ç©å¨è¡¨åä¸åå¨å·®å¼,å©ç¨è¡¨åå·®å¼æç»ç»å¨å®ç¹å¼è¡¨è¾¾äº§ççå·®å¼æ¥å
éæ¤ç©åºå å°±æ¯è¡¨åå
éãSançç¨è¡¨åå·®å¼ä»æåè¥ ä¸å
éåºèµ¤éç´ åæé
¶åºå (Sunç,1992)ã表åå
éå¨çç¥ä¸è¯å¾å°è¡¨åä¸åºå ç»ææåºå 表达çç¹å¾è系起æ¥,ä»èå离ç¹å®è¡¨åç¸å
³åºå ,åæ±ä¸å¿
äºå
ç¥éåºå ççååè½æå¾è°±å®ä½ï¼æ ¹æ®åºå ç表达æåºå°±ç´æ¥å离该åºå (Brown,1994)ã
ãã6ãmRNAå·®å¼æ¾ç¤º(mRNA differential display)
ãã1993å¹´LiangåAverboukh çç§å¦å®¶æåºäºmRNAå·®å¼æ¾ç¤º(mRNA DD, mRNA differential display)çæ¹æ¡(Liangç,1993)ãè¿ä¸æ¹æ¡çä¾æ®æ¯å¨é«ççæ ¸çç©ä¸ææççå½è¿ç¨åç
çåå,ä¸è®ºæ¯ç±ååºå æ§å¶çè¿æ¯ç±å¤åºå æ§å¶ ç,æç»é½æ¯éè¿åºå 表达çè´¨æéçå·®å¼èä½ç°åºæ¥ãç 究åºå 表达差å¼,ç 究两åºå ç»å·®å¼è¡¨è¾¾åºå çå离,为å
éå¤ææ§ç¶ç¸å
³åºå å¼è¾äºéè¦çéå¾ãè¯¥æ¹ æ¡å¯ä»¥æ£æµãå离åºå
¨é¿ä»»ä½é¨åæçªåçmRNA,å
¶åºæ¬ç¨åºæ¯:(1)æå两ç§ç»èçmRNA,å转å½åæ为2ç§cDNAã(2) 以ä¸å®çå¼ç©ä½éæºèåé
¶é¾ååºã(3) éè¿æ©å¢äº§ç©ççµæ³³åæ,å离åºä¸åæ ·åé´çå·®å¼æ¡å¸¦ã(4)å°å·®å¼DNAåææ¢éã(5) å¨cDNAæåºæåºå ç»æåºä¸çéåºå 并ä½åè½åæ(Baeurç,1993)ãLiangåPardeeå建ç«äºmRNAå·®å«æ¾ç¤ºPCRæ¹æ³ (LiangåPardee,1992),该æ¹æ³å¯ä»¥åæ¶åæå ä¸ªæ ·åé´åºå ç表达,æ£æµçµæ度é«,PCRæ©å¢å,ä¸äºè¡¨è¾¾éå¾ä½çmRNAä¹è½è¢«æ£æµåº æ¥,åºç¨PCRåDNAæµåºï¼ä¸¤ç§ææ¯ç®åæè¡,ç®å已被æåå°ç¨æ¥å离å°éº¦çæ¿èç½åºå (Joshiç,1996)å水稻èç³è°èåºå (Tsengç, 1995)çã
ãã7ãåæ³æ交(Subtractive hybridization)
ããLeeç1991å¹´æåºåæ³æ交ææ¯ (Leeç,1991),æ¤ç©å¨çé¿åè²è¿ç¨ä¸ä¸åç»ç»æåä¸ç»ç»çä¸ååè²é¶æ®µ,ç±äºåºå ç¹å¼æ§ç表达,å
¶mRNA表ç°ä¸å,è¿æ ·ä»è¡¨è¾¾ç¹å¼åºå çç»ç» ä¸æå mRNA,å转å½ä¸ºcDNA,ä»æ ç¹å¼åºå 表达çç»ç»ä¸æåmRNA,两è
æ交,å¨è¡¨è¾¾ç¹å¼åºå çç»ç»åæ ç¹å¼åºå 表达çç»ç»ä¸å表达çåºå 产ç©å½¢ææ交 åå,èç¹å¼mRNA转å½çcDNAä»ä¿æåé¾ç¶æ,æè¿ç§åé¾cDNAå离åºæ¥å³ä¸ºå·®å¼è¡¨è¾¾çåºå ,Chongçç¨æ¤ææ¯å
éäºå°éº¦æ¥åç¸å
³åºå (Chongç,1994)ã
ãã8ãPCRæ©å¢å
é
ããè¿æ¯ä¸ç§åèå·²ç¥åºå çåºåå
éåºå çæ¹æ³ãç®åå·²ç»ç¥éäºå¾å¤æ¤ç©åºå çåº å,å½å
é类似åºå æ¶å¯å
ä»Gene bankåºä¸æ¾å°æå
³åºå åºå,ç¨PCRæ¹æ³å
éä¸åæ¤ç©çåºå ãåºæ¬æ¹æ³æ¯æ ¹æ®å·²ç¥åºå çåºå设计并åæä¸å¯¹å¼ç©,ä»æ¤ç©ä¸æåDNAè¿è¡PCRæ©å¢, æ©å¢çç段纯ååè¿æ¥å°åéçè½½ä½ä¸,ç¨é
¶ååæååºååææ£æµéç»å,并ä¸å·²ç¥åºå åºåè¿è¡æ¯è¾,å¦ç®åå·²å¨çç±³ã水稻ãåæ¥èµã巴西è±çæ¤ç©ä¸åç¦»åº å¯å«ç²ç¡«æ°¨é
¸çèç½åå
¶ç¼ç åºå ,æ ¹æ®Masumuraç(1989)å表ç10KD水稻é溶èç½åºå åºååæä¸å¯¹å¼ç©,ç广ç«çå
éäºæ°´ç¨»10KDé溶 èç½åºå (ç广ç«ç,1994)ã
ãã9ãä¾æ®åºååæºæ§å
éåºå
ããçç©çç§ãå±ä¹é´ç¼ç åºå åºåçåæºæ§é«äºéç¼ç åºçåºåãæ¤æ¹ æ³çåºæ¬ä½æ³æ¯å¨å
¶å®ç§å±çåæºåºå 被å
éçåæä¸,æ建cDNAæåºæåºå ç»æåº,ç¶å以已ç¥çåºå åºå为æ¢éæ¥çéç®çå
éã马德é¦çæ ¹æ®æç®æ¥éç çè碱éè±æ°¢é
¶(BADH)åºå çåºåä½äºè èçè碱éè±æ°¢é
¶åºå çå
éååºååæ(马德é¦ç,1996)ã
ãã综ä¸æè¿°,å¯è§åç°åå
éåº å çè¿ç¨æ¯è°å·¨åå¯ææ¶è·ç,å åå¹´æ¥åå½ç§å¦å®¶å¨åºå å
éè¿ä¸ææ¿å¨äººå¿ççç©é«ææ¯é¢åå
èµ°è¿äºè°é¾èåæ²æçåç¨,ä»èåé ååå±äºä¸è¿°ç§ç§æ¤ç©åº å å
éçæ¹æ³,使人类å¨è®¤è¯èªç¶ãææ¡èªç¶çéè·¯ä¸ååè¿äºä¸æ¥ãåè¾æåé çæå°±åææ¯æ ç为æ们æåå°å
éæ¤ç©åºå æä¾äºå¿«æ·åé«æçéå¾ãå©ç¨å·²ç¥ åºåå
éåºå ,ç¨åç§æåå±çå·²ç¥çåæºåºåçéåºå é½æ¯è¾å®¹æ,éåäºå
éé£äºç 究è¾æç许å¤éè¦åä½ç©çåºå ãè·å¾æ纯çèç½è´¨æ¯åè½å
éçå
³é®,é çèç½è´¨çº¯åææ¯çæé«,åè½å
éå°åæ¥å®çæ½å¨ä½ç¨ãéçæ¤ç©éä¼ å¾è°±ä¸åºå å®ä½åºç¡ç 究工ä½çæé«,å®ä½å
éå°åæ¥å
¶å·¨å¤§çä½ç¨ã
温馨提示:答案为网友推荐,仅供参考