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单酶切载体自连
单酶切
后粘性末端连接会存在
载体自连
的问题,是否正确?
答:
【正确】当用
单酶切
时,虽然产生了互补的粘性末端,但由于
载体
存在
自连
现象,重新形成稳定的共价闭合环状结构,导致只含有载体DA的转化子的比例大幅上升,给重组体的筛选带来麻烦。
载体单酶切
后去磷酸化,再与酶切的片段连接,总是
自连
,谁帮分析下?
答:
不然不太可能
自连
。我最近在做
单酶切载体
和片段,但是载体单酶切后没有去磷酸化,T4连接后转化进DH5α,长出很多很密集的菌落,挑了单菌落后摇菌一晚也浑浊了,提质粒后显示质粒浓度特别小,只有30-40 ng/ul,载体本身大小是11k,如果插入了插入片段后,大小是13k。送了一次菌液显示模板浓度小,...
...
单酶切
后 怎么把目的基因连到已经酶切过的
载体
上 如何防止
自连
_百度...
答:
单酶切
要想防止
自连
,最好的办法是把载体酶切产物脱磷酸。脱了磷酸的载体就无法自连,它只能和目的片段连接。如果不想脱磷,可以在连接反应体系中加大目的片段的数量,提高阳性克隆的比例,但这不能完全避免自连。不过最好的办法还是做双酶切。单酶切连接实在麻烦。
再次请教生物问题
答:
载体自连
最容易发生的情况有两种,一种是
单酶切
,一种是平末端连接。这两种情况下,通常为了防止载体自连会对酶切后的载体使用碱性磷酸酶处理,将DNA 5‘端的-P基团置换成-OH,这样会一定程度的防止载体自连。
单酶切
连接的问题?
答:
1确认连接体系没有问题。2 确认设计引物的时候两边酶切位点的碱基和保护碱基没有问题。3 考虑PCR产物回收产物浓度提高一点。连T一般很容易的,我也做的
单酶切
连接,祝成功啦。
...上面都有两种酶的切割位点,为什么用一种
酶切
后,再连接,有三种连接产 ...
答:
单酶切来做连接无法选择目的片断插入的方向,插入产物有正反向两种。
单酶切载体
也很容易产生
自连
(所以单酶切为了防止自连常用ciap处理)不同酶的双酶切做连接可以保证插入方向性,也能防止自连,理论产物只有一种
连接时间较长
载体
为什么会
自连
答:
载体自连
是你
酶切
后没有去磷酸化!
将目的基因与
载体
混合并用DNA
连接酶
处理后,会出现几种结果,
答:
这要看你的目的基因和载体是怎么处理的:1.
单酶切
平端, 粘端: 可能有目的基因自连,
载体自连
,目的基因与
载体连接
。2.双酶切平端:可能有目的基因自连,载体自连,目的基因与载体连接。3. 双酶切粘端: 理论上只可能是目的基因与载体连接。
基因工程使用双酶切和
单酶切
答:
双
酶切
之后,由于用的两种酶切出来的粘性末端序列不一样,所以一般
载体
不会再
自连
。而你说的载体和基因片段再重新连起来,也是不太可能的,因为连接反应是需要ATP提供能量的,酶切体系里面没有ATP,所以不会再连接。质粒切开后,一般是通过琼脂糖凝胶电泳的方法,把大小不同的两个片段分离开,然后把...
质粒和目的基因能用同种限制
酶切
吗? 会不会
自连
?
答:
质粒用一种内切酶切会
自连
的,所以一般做克隆进来避免用
单酶切
。如果没有办法,只能用单酶切,最好对质粒进行碱性磷酸酶处理,去磷,这样能够降低自连的比例,增加克隆成功的概率。目的基因单酶切一般不会自连的。
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