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如何筛选阳性克隆
阳性克隆筛选
方法及原理
答:
1、蓝白筛选法:某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶基因片段
,在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一段含多种单一限制酶位点的DNA序列。2、标志筛选法:某些质粒携带某种标志基因,当外源DNA插入到该标志基因中时,该标志基因将被破坏,使重组克隆具有某种标志性表型或特性,而非重组克隆则无此标志性...
G418
筛选阳性克隆
的优化方法有哪些?
答:
对于阴性克隆,采取刮除的方法移除,然后对阳性克隆进行消化,继续进行筛选培养
。另一种方法是
使用套环
,将套环固定在阳性克隆周围,然后在套环内加入胰蛋白酶或EDTA进行消化。消化完成后的物质会被吸收到新的培养孔中进行培养。最后,
通过有限稀释法
,将这些阳性克隆分散到96孔板中进行精确筛选,确保每个孔只...
基因克隆有哪些步骤,
如何筛选阳性克隆
答:
筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法
,就是在载体上,序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列,如果不被破坏,产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物,形成蓝色产物。如果有目的序列插入,这个酶就不能表达,形成的克隆就是白色的。挑取阳性克隆,测序确认无变异和方向后,扩增质粒,提纯质粒。
做基因敲除
如何
快速筛出
阳性克隆
?
答:
通过病毒法
,化学转染法或电转法将gRNA和Cas9转入细胞中,根据转染方法不同进行不同时长的药筛,药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序验证,筛选出基因敲除的阳性克隆。
琼脂糖凝胶电泳
如何
判别是
阳性克隆
?
答:
1、琼脂糖凝胶电泳判别是阳性克隆琼脂糖凝胶电泳判别是阳性克隆
根据重组子遗传重组表型改变的筛选法
:利用抗生素抗性基因进行筛选,
利用报告基因筛选克隆子
,据重组子结构特征的筛选法,琼脂糖凝胶电泳比较重组DNA的大小。2、限制性内切酶分析。印迹杂交方法。PCR法。
什么叫
阳性克隆筛选
法? 请打击帮帮忙!!
答:
导入了报告基因的大肠杆菌在含抑制性物质的培养基上就可以生长,而不含报告基因的大肠杆菌(就是转化失败的)就不能生长。这样过了两三天后,在培养基上看见的菌落就是
阳性
科隆。这一过程就是阳性科隆
筛选
。一般选用的报告基因像青霉素抗性基因,链霉素抗性基因等等。如果还想了解得更详细,就去买本分子...
阳性克隆
过程中
筛选
的目的
答:
将载体转入大肠杆菌,在含有Amp的培养基上培养,蓝白斑
筛选阳性克隆
,再提取质粒DNA,PCR检测就可以了。
如何筛选
在真核细胞中的
阳性克隆
答:
如何筛选
在真核细胞中的阳性克BamH 1 的酶切位点在tet上,所以酶切重组后,质粒就不会再表达四环素抗性抗性了,
筛选阳性克隆
要挑选在Amp平板上生长的菌株,而在Tet平板上生长的菌株是插入失败的。
大肠杆菌GFP是什么菌?在实验室中
如何筛选
抗氨苄青霉素
阳性克隆
菌株?
答:
筛选
氨苄青霉素抗性的
阳性克隆
很简单,将氨苄青霉素加到所用培养基中,终浓度100ug/ml,把要筛选的菌液涂布其上,能长出的就是氨苄青霉素阳性菌株。要注意的是生长时间不可太长,因为水解氨苄青霉素的beta-内酰胺酶能分泌到细菌外,导致阳性菌周围的阴性菌也能生长,即所谓的卫星菌落。
质粒转入细胞后使用抗生素G418
怎样
检测到
阳性克隆
答:
G418通过干扰核糖体的功能而阻断细胞的蛋白合成,
阳性克隆
中因含有抗性基因可以存活。由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质,所以
筛选
不能太早 一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降,所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液,这时药物浓度可以...
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