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抗生素筛选阳性克隆的原理
质粒转入细胞后使用
抗生素
G418怎样检测到
阳性克隆
答:
G418通过干扰核糖体的功能而阻断细胞的蛋白合成,阳性克隆中因含有抗性基因可以存活
。由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质,所以筛选不能太早 一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降,所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液,这时药物浓度可以...
...DNA 片段
克隆
,经
抗生素筛选
为何会出现假阳性?如何防止假
阳性的
产生...
答:
质粒被切以后,和目的基因放在一个体系中,加入DNA连接酶,有可能质粒在切口处重新接上。这样的 质粒上面有标记基因,但没有目的基因。因此,这样的质粒导入受体细胞后也有抗性。这就是假
阳性
。还有一种假阳性,就是目的基因和质粒在连接时,方向接反了。如何防止假阳性,方法有三种。第一,用同尾酶去切...
基因克隆中蓝白斑筛选法
筛选阳性克隆的原理
.
答:
蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法: 是根据载体的遗传特征筛选重组子,如α-互补、抗生素基因等
。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段,其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点(MCS),它并不破坏读框,但可使少数...
关于转基因的
抗生素
抗性
答:
抗生素的作用就是区分转基因是否成功
。因为携带抗生素的抗性基因和你希望转的基因是连在一起的,如果转化成功,那么抗生素基因也在里面,通过在抗生素作用下进行抗性筛选,就能得到阳性的克隆子。一般做微生物的转化用抗生素基因,对受体几乎上没什么影响,不会遗传。如果是植物或动物,是不会用抗性基因的!...
G418的选择细胞
原理是什么
?
答:
只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想要的强分泌目的蛋白的,遗传稳定的细胞克隆
。G418(Geneticin,遗传霉素) 是一种氨基糖苷类抗生素 ,在分子遗传试验中,是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。它通过抑制转座子Tn601,Tn5 的基因,干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞产生毒素 ,包括...
基因
克隆
答:
同样,使用菌落PCR和Sanger测序进行
阳性克隆
子pcDNA3.1-PVT1的
筛选
(图26)。(3) 无缝克隆 无缝
克隆的
一个重要优势是不需要考虑待克隆片段中的酶切位点情况,因此直接选择相应的酶切位点将载体线性化后,根据载体的线性化末端进行同源引物的设计,PCR扩增目的基因并纯化后直接进行重组连接和转化(图27)。以下,我们同样...
抗生素
基因与抗生素抗性基因的作用
答:
具有***基因就说明能够 产生 ***物质,比如 具有“
抗生素
基因”的微生物就能生产“抗生素”,而具有“胰岛素基因”的细胞就能分泌“胰岛素”。。。具有***抗性基因就说明能够 抵抗 ***物质。首先,“抗生素”是一种是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)产生的具有抗病原体或其它活性的代谢产物,...
如何快速了解接触的质粒(四)
答:
上面质粒图谱中圈出的AmpR,NeoR/KanR等表示质粒中抗性
筛选
标签,方便后面筛选出
阳性克隆
(重组成功的阳性质粒;自连的假阳性质粒需要后续质粒测序验证)。抗性基因可以参考用来区分质粒的种类,像复制起点一样,质粒中有两个复制起点一般为穿梭质粒;类似的质粒中有两种抗性基因一般为穿梭质粒(pcDNA3.1(+))...
...只要质粒上含有
抗生素
基因就能在抗生素培养液中生存,如果没表达呢...
答:
我们是将目的基因在质粒的多
克隆
位点(MCS)处连接,成为重组质粒,质粒上要有相应的标记基因以方便
筛选
转化子,一般就是用抗生素抗性基因,在含有
抗生素的
选择培养基中培养菌体就可筛选出成功导入质粒的菌落。当然了,也不排除导入的质粒是空质粒,就是说目的基因没有成功结合上去。所以这时候我们要对...
系统分析你掌握的几种重组
阳性克隆
子的
筛选
和鉴定方法
答:
:(1)根据重组子遗传重组表型改变的筛选法 1)利用
抗生素
抗性基因进行筛选 2)通过α互补使菌产生颜色来筛选 3)利用报告基因
筛选克隆
子 (2)根据重组子结构特征的筛选法 1)琼脂糖凝胶电泳比较重组DNA的大小 2)限制性内切酶分析 3)印迹杂交方法 4)PCR法 (3)根据目的基因表达产物采用免疫化学方法筛选。
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