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筛选阳性克隆的常用方法
阳性克隆筛选方法
及原理
答:
1、蓝白筛选法:某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶基因片段
,在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一段含多种单一限制酶位点的DNA序列。2、标志筛选法:某些质粒携带某种标志基因,当外源DNA插入到该标志基因中时,该标志基因将被破坏,使重组克隆具有某种标志性表型或特性,而非重组克隆则无此标志性...
系统分析你掌握的几种重组
阳性克隆
子的
筛选
和鉴定
方法
答:
【答案】:(1)
根据重组子遗传重组表型改变的筛选法
1)利用抗生素抗性基因进行筛选 2)通过α互补使菌产生颜色来筛选 3)利用报告基因筛选克隆子
(2)根据重组子结构特征的筛选法
1)琼脂糖凝胶电泳比较重组DNA的大小
2)限制性内切酶分析 3)印迹杂交方法 4)PCR法 (3)根据目的基因表达产物采用免疫化学方法...
质粒转化后得到的
阳性克隆
有哪些
方法
可以鉴定?并说明鉴定的依据。
答:
1
菌落PCR
。设计引物扩增质粒特有的目的片段,如果阳性克隆里面有改片段,则说明转化成功。2
快抽质粒
。将阳性菌落划平板,几个小时后,富集菌,然后快速抽提。看质粒大小有没有插入目的片段。
3 提质粒,酶切鉴定。4 提质粒测序
。1,2 都是早期的快速鉴定,假阳性高;3,4慢,但是比较确信。一般组合来...
做基因敲除如何快速筛出
阳性克隆
?
答:
通过病毒法,化学转染法或电转法将gRNA和Cas9转入细胞中
,根据转染方法不同进行不同时长的药筛,药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序验证,筛选出基因敲除的阳性克隆。
G418
筛选阳性克隆的
优化
方法
有哪些?
答:
另一种方法是使用套环
,将套环固定在阳性克隆周围,然后在套环内加入胰蛋白酶或EDTA进行消化。消化完成后的物质会被吸收到新的培养孔中进行培养。最后,通过有限稀释法,将这些阳性克隆分散到96孔板中进行精确筛选,确保每个孔只含有单一的阳性克隆。通过这样的步骤,筛选过程更为精确和有效,提高了阳性克隆...
基因克隆有哪些步骤,如何
筛选阳性克隆
答:
筛选阳性克隆
一般常采用蓝白
克隆方法
,就是在载体上,序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列,如果不被破坏,产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物,形成蓝色产物。如果有目的序列插入,这个酶就不能表达,形成的克隆就是白色的。挑取阳性克隆,测序确认无变异和方向后,扩增质粒,提纯质粒。
求助通用引物验证
阳性克隆
答:
通用引物验证
阳性克隆的方法
通常涉及PCR技术。PCR(聚合酶链式反应)是一种分子生物学技术,通过DNA复制在体外扩增特定的DNA片段。在验证阳性克隆时,通用引物被设计用来与克隆载体上的通用序列结合,从而扩增出插入片段。这种方法可以快速、准确地鉴定出含有目的基因的阳性克隆。通用引物的设计原则是基于载体上...
琼脂糖凝胶电泳如何判别是
阳性克隆
?
答:
1、琼脂糖凝胶电泳判别是阳性克隆琼脂糖凝胶电泳判别是阳性克隆
根据重组子遗传重组表型改变的筛选法
:利用抗生素抗性基因进行筛选,
利用报告基因筛选克隆子
,据重组子结构特征的筛选法,琼脂糖凝胶电泳比较重组DNA的大小。2、限制性内切酶分析。印迹杂交方法。PCR法。
克隆文库中,怎样检测
阳性克隆
子?
答:
最
常用的方法
是在PCR之后 用Northern杂交
的方式
检测 这个效果很好的 当然了 如果实验室里面有专用的芯片就更好了
基因
克隆的
基本步骤有哪些
答:
从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即
阳性克隆的
过程就是筛选。发展起来的成熟
筛选方法
如下:(1)插入失活法:外源DNA片段插入到位于筛选标记基因(抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因)的多克隆位点后,会造成标记基因失活,表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变,...
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