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t4连接酶连接体系摩尔比
t4连接酶连接体系
怎么计算
答:
最适克隆载体/插入片段
摩尔比
。经查询
t4连接酶连接体系
的相关资料得知,t4连接酶连接体系计算公式为最适克隆载体/插入片段摩尔比。T4-DNA连接酶即T4DNA连接酶,可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合。
请教,关于KPn1高温灭活纯化和
T4连接酶体系
的生化问题
答:
自己回答:现在
连接
的
体系
应该是没什么问题,可能是双酶切的时候没有完全把位点切开,毕竟两种酶在共用buffer的情况下存在竞争,虽然之前做过交叉试验验证了可行性。目前的计划是分别单酶切后纯化,保证能切开。 我们采用的
摩尔比
是片段:载体=3:1,理论是可行的,
T4
ligase的效率是可信的。总之,还要...
急!平末端
连接
问题
答:
你用的是T4连接酶吧?平末端连接,一定要用大量的目的片段去竞争载体自连,
一般要保证你的片段和你的载体的摩尔数目之比要达到8:1以上才能达到比较高的连接效率
。10微升体系中,一般T4连接酶都是用0.5微升的。然后你按照10:1摩尔比加入你的片段和载体就行了,用水补足体积。此外,还有一点,平末端...
高中生物
答:
(1)磷酸二酯键 (2)病毒、噬菌体 (3)核糖体(具体是RNA聚合酶)(4)BamHI CaCl2 方案:1.BamHI分别切目的基因和质粒,50ul
体系
,37℃,2.5h。跑电泳,条带单一,目的基因直接过柱纯化,质粒切胶回收。2.
T4连接酶
链接质粒和目的基因,
摩尔比
目的:质粒=3:1,16℃,过夜。3. 重组质...
平末端如何
连接
答:
然后用
T4
DNA
连接酶
将不同片段连接起来。该法形成重组DNA分子的效率低,只及粘性末端法的1%。2、人工接头法,1976年发展起来的。首先用化学法
合成
具有某种限制性内切酶识别位点的序列,通过T4 DNA连接酶的作用连接到两种待连接片段的平末端上,然后用这种限制性内切酶处理产生粘性末端,实现体外重组。
T4连接
后对其质粒PCR条带不亮,为什么?
酶
切没有条带,是否连接上?
答:
很显然你的质粒没有构建成功。感觉是
连接
出了问题,pBI121载体很大,回收比较困难,建议你测一下回收后的浓度。如果太低的话,建议加大
酶
切量。121载体至少应该达到50-100ng,然后再按1:3-10
摩尔比
加入小片段.至于PCR验证出现假阳性,太正常了。还是酶切比较靠谱。
双
酶
切时,是直接用pcr产物就可以,还是需要
答:
而该
酶
浓度约为15单位/微升,在除外酶降解的 因素外,该酶可分解15μg的DNA,而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg,而PCR纯化后的产物(50
体系
)约为3μg,所以即便全部加进去,只要纯化的 质量好,酶切完全切得动。2、酶切、回收后的PCR产物与载体的
连接
摩尔比
的计算,很多人凭经验也可以。
DNA重组质粒载体中的快速克隆
答:
将琼脂糖加热至70℃使其熔化,然后混合外源DNA和质粒载体,保持2:1的
摩尔比
。设立质粒载体和外源DNA单独的对照反应。将混合物在37℃下温育5-10分钟,随后加入预冷的2x
T4
噬体DNA
连接酶
混合物,确保在凝胶固化前充分混合,于16℃下进行12-16小时连接反应。连接酶混合物的制备包括:1mol/L Tris-HCl(p...
DNA重组的质粒载体中的快速克隆
答:
这一方法寻平端连接和粘端连接都同样奏效,但需大量的
连接酶
,而且效率要比标准操作方案约低一个数量级。1)用适当的限制酶消化外源DNA,其量应足以产生约0.2μg的靶片段。反应体积应为20μl或更小。在另一管中,用相应的限制酶消化约0.5μg载体DNA,总反应体积为20μl或更小。如载体DNA带...
简述DNA重组与分子克隆化基本原理与过程
答:
T4
噬菌体NDA
连接酶
0.1Weiss单位 5mmol/L ATP 1μl 于16℃温育1-4小时 10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液 200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6) 50mmol/K MgCl2 50mmol/L二硫苏糖醇 500μg/ml牛血清白蛋白(组分V.Sigma产品)(可用可不用) 该缓训液应分装成小份,贮存于-20℃。 另外,再设立两个对照反应,其中含有(...
1
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