急！平末端连接问题

Question

最近在做载体构建，有一个5k左右的片段要连接到一个12k左右的载体骨架上，两端都是平末端，始终连不上，不知道连接体系需要怎样的优化，连接酶要多，但是一个10ul的体系中，到底要加多少酶？？？以及目的片段和载体各是多少才合适？？？？没做过，身边的人也没有经验，做的非常辛苦啊~~~
请各位高手指点指点啊！！！谢谢
载体已经去磷酸化处理

Answer 1

你用的是T4连接酶吧？
平末端连接，一定要用大量的目的片段去竞争载体自连，一般要保证你的片段和你的载体的摩尔数目之比要达到8：1以上才能达到比较高的连接效率。

10微升体系中，一般T4连接酶都是用0.5微升的。然后你按照10：1摩尔比加入你的片段和载体就行了，用水补足体积。

此外，还有一点，平末端连接失败的主要原因是载体自连很严重，你可以用磷酸酶处理载体，将载体去磷酸化，也就是去除载体末端的磷酸集团，这样可以大大降低载体自连概率，增加链接成功率。

Answer 2

二楼正解。不过你的T4 ligase浓度是多少？你的insertion DNA 和 vector浓度又是多少？一般来说商业用T4 ligase不会少于20，000u/ml,你的insertion size又有5k，还需要10：1于vector的比例加入到10ul反应体系当中去，0.5ul酶应该足够用了。

看你连接连得那么辛苦，给你介绍一个新朋友吧，不是双汇火腿肠，而是clontech的In-fusion protocol。不过不知道国内有没有卖这种试剂盒的哈，去年的技术...
http://clontech.takara-bio.co.jp/manuals/pdf/PT4065-1.pdf本回答被提问者采纳

Answer 3

你的外源片段末端有没有磷酸化？