1、平末端法,有些核酸内切酶切出的DNA分子是平末端,对DNA分子的单链末端亦可用核酸酶S1或DNA聚合酶Ⅰ来修平或补齐,然后用T4 DNA连接酶将不同片段连接起来。该法形成重组DNA分子的效率低,只及粘性末端法的1%。
2、人工接头法,1976年发展起来的。首先用化学法合成具有某种限制性内切酶识别位点的序列,通过T4 DNA连接酶的作用连接到两种待连接片段的平末端上,然后用这种限制性内切酶处理产生粘性末端,实现体外重组。
扩展资料
提高平末端连接效率的措施
1、提高T4DNA连接酶的浓度。
2、提高DNA片段的浓度。
3、降低ATP浓度,以增强连接物与DNA结合。
4、加入多胺化合物,如亚精胺,降低DNA的静电排斥力。
5、加浓缩剂,如大分子排阻物聚乙二醇(PEG)、强水化物三氯化六氨钴等。
E·coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来,不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。而T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端,但连接平末端之间的效率比较低。
参考资料来源:百度百科-平末端
参考资料来源:百度百科-基因拼接方法
可使用人工关节法。
其发展于1976年。首先,采用化学方法合成具有一定限制性内切酶识别位点的序列源序列,通过T4-DNA连接酶连接到两种待连接片段的平端,然后通过这种限制性内切酶处理产生粘端,实现体外重组。
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提高平末端连接效率的措施
1、提高t4dna连接酶的浓度。
2、增加DNA片段的浓度。
3、降低ATP浓度,增强连接子与DNA的结合。
4、多胺化合物的加入,如亚精胺,减少了DNA的静电排斥。
5、加入聚乙二醇(PEG)、强水合物、三氯化钴等浓缩剂。
E、coli-DNA连接酶只能连接dsDNA片段的互补粘端,不能连接dsDNA片段的平端。T4-DNA连接酶不仅可以“缝合”双链DNA片段的互补粘端,还可以“缝合”双链DNA片段的平端,但连接平端的效率相对较低。
参考资料来源:百度百科-平末端
参考资料来源:百度百科-基因拼接方法
本回答被网友采纳T4DNA连接酶也能催化限制性内切酶切割产生DNA平末端的连接。如果目的序列和载体上没有相同的限制性内切酶位点可供利用,用不同的限制性内切酶切割后的粘性末端不能互补结合。
则可用适当的酶将DNA突出的末端削平或补齐成平末端,再用T4DNA连接酶连接,但平末端连接要比粘性末端连接的效率低得多。
在分子生物学的研究中,DNA末端的连接是一极为常用的基本操作,可分为粘末端和平末端连接,
粘末端连接效率相对较高,平末端的连接效率一般非常低, 但平末端连接具有普适性,被广泛地用于将外源DNA片段的相互连接当中。
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提高平末端连接效率的措施
1、提高T4DNA连接酶的浓度;
2、提高DNA片段的浓度;
3、降低ATP浓度,以增强连接物与DNA结合;
4、加入多胺化合物,如亚精胺,降低DNA的静电排斥力;
5、加浓缩剂,如大分子排阻物聚乙二醇(PEG)、强水化物三氯化六氨钴等。
6、通常为了提高平末端的连接效率,实验者可以采用反应混合物具有低浓度(0.5mol/l)的ATP、不存在亚精胺一类的多胺、极高浓度的连接酶(50Weiss单位/ml)、高浓度的平末端、加入凝聚剂等方法,但对于极其稀有的基因来说,这些方法都不适用。
参考资料:百度百科-平末端
本回答被网友采纳当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时,切开的DNA两条单链的切口,是平整的,这样的切口叫平末端。
被限制性内切酶切断的DNA分子片段,需要一种特殊的酶——DNA连接酶来缝合,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。E·coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来,不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。而T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端,但连接平末端之间的效率比较低。
平末端连接:
T4DNA连接酶也能催化限制性内切酶切割产生DNA平末端的连接。如果目的序列和 载体
上没有相同的限制性内切酶位点可供利用,用不同的限制性内切酶切割后的粘性末端不能互补结合,则可用适当的酶将DNA突出的末端削平或补齐成平末端,再用T4DNA连接酶连接,但平末端连接要比粘性末端连接的效率低得多。
提高平末端连接效率的措施:
①提高T4DNA连接酶的浓度;②提高DNA片段的浓度;③降低ATP浓度,以增强连接物与DNA结合;④加入多胺化合物,如亚精胺,降低DNA的静电排斥力;⑤加浓缩剂,如大分子排阻物聚乙二醇(PEG)、强水化物三氯化六氨钴等。