预测RNA二级结构如下进行：
1. 选择file|RNA fold single strand启动模块，单击sequence按键，打开对话框以载入序列，此序列必需以.SEQ为扩展文件名，其它序列文件可在序列编辑器中转为此格式。注意必需为大写字母。
2. 输入文件名后，缺省值将填充在剩下的区域，这些值可改变。选取 Generate Save File选项，在执行算法后生成存盘文件，此存盘文件用于重新折叠与生成点阵图。
3. 在此碱基可被强制为单链或双链或螺旋。
4. 单击开始键，开始预测运算。
5. 需要的话，选择Draw structure，在绘图模块中看预测的二级结构结果。输出的二级结构以最小自由能顺序排列。但由于方法的限制与热力学参数的简化，第一个结构并不一定为实际的RNA结构，
要折叠一个已存贮为.seq文件的序列，可选择菜单选项file|fold RNA single strand，直接进入折叠窗口。或单击工具条中的fold RNA single strand键。
折叠RNA单链
次优结构输出的数量由用户输入的两个参数决定。
Max % Energy Difference:设定输出结构的自由能允许与最小自由能相差的百分数。例如如果结构的最小自由能为-100 kcal/mol，最大能量百分误差为10,将输出所有能量为等于或大于-90 kcal/mol的结构。
Max number of structures: 设定生成的结构数量。最大为1000.
程序输出预测结构直到以上任何一个参数达到要求。
Window size:此参数控制次优结构互相之间有多少不同。小的Windows size只允许生成非常接近的结构，大的Windows size则需要更大的不同。
Advanced Options:除非特殊情况，不推荐使用。
RNA折叠单链模块
强制一个碱基为单链
在二级结构预测时，用户可选择不配对的碱基。方法如下：
1. 在序列文件中，不配对碱基使用小写字母表示。
2. 选择要折叠的序列后，选择Force/Single菜单，进入文本编辑框，输入不配对碱基从5'端的位置序号。单击OK。
查看目前的选择碱基，选择Force|Current.重新设定选择碱基，选择Force|Reset.菜单命令。
强制一个碱基为双链
用户能选择必须配对的碱基，由Force|Double菜单命令完成，操作类似上述。
RNA折叠单链模块
强制一个碱基对
选择菜单命令Force|Pair.完成。
折叠模块
使用限制
尽管作者努力，预测的最低自由能结构可能并不是自然界存在的形式，特别当序列长度为几百时，但至少其可能的结构已限制在一定数量内。
最近的研究证明最低自由能结构，含有大约70%正确的碱基对，但前1000个最佳次优结构中的一个结构会含有大于95%的正确的碱基对。因此建议进行实验以限制预测的结构。例如，化学修饰数据可帮助识别存在与自然界中的结构。Mix&Match模块的功能便是帮助你使用此类数据识别最可能自然结构。
RNAstructure现在也提供其它几种折叠的预测，如单链DNA折叠，RNA或DNA寡聚体的分子间折叠。并提供重新折叠选项refold重新生成已折叠序列的次优结构。
单链DNA折叠
使用John SantaLucia, Jr.及其同事提供的热力学参数，也可折叠DNA序列。
RNA或DNA分子间折叠
可使用RNA或DNA参数确定寡聚体的分子间二级结构，这需要选定两个序列。
分子间折叠使用初始参数以正确决定自由能。但也有一些限制。程序算法不能预测pseudoknots，对于分子间折叠意味着pseudoknots结构如kissing hairpins结构不能被正确预测，因此，使用的分子间折叠的序列应很短。
Refold
重新折叠选项可读取一个由任何折叠模块生成的存盘文件*.sav，并生成一个不同的次优结构。因为程序算法分为两部门，因此这功能非常有帮助。第一步是非常慢的一步，重新折叠便读取第一步的数据快速生成其它结构。
EFN2 能量函数2
此模块计算结构的自由能
1. 单击.CT File按键,打开对话框输入.CT文件的名字，这是一个含有二级结构信息的文件格式，以CT为扩展名。
2. 对于输出文件.OUT，给出了缺省名称，可单击Out file 按键更改
3. 单击Start 按键
4. 输出两个文本文件扩展名分别为.CT与.OUT。
5. 使用文本文件编辑器打开文件，
6. 结构以自由能大小排列，
绘图模块
1 选择菜单命令File|Draw.
2. 选择一个已存在的.CT文件绘图
如果.CT文件含有超过一个结构，可以选择观看哪个结构。在菜单中选择View|Structure number，选择想要观看的结构。或按住Control键按动上箭头或下箭头也可更改现有显示结构。
放大缩小
选择View|Zoom或按住Control键按动左箭头或右箭头。
打印
选择File|Print.
拷贝到剪贴板
选择Copy菜单place a black and white bitmap on the clipboard将其拷贝到剪贴板，并可复制到其它应用程序。
可在view|counterclockwise菜单选项选择是顺时针还是逆时针绘图。
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