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ä¸ãå¼è¨
å¨è®¸å¤çç»èçå½æ´»å¨ä¸,ä¾å¦DNAå¤å¶ãmRNA转å½ä¸ä¿®é¥°ä»¥åç
æ¯çææçé½æ¶åå°DNAä¸èç½è´¨ä¹é´çç¸äºä½ç¨çé®é¢.
éç»DNAææ¯çåå±,人们已å离å°äºè®¸å¤éè¦çåºå .ç°å¨çå
³é®é®é¢æ¯éè¦æ示ç¯å¢å åååè²ä¿¡å·ç©¶ç«æ¯å¦ä½æ§å¶åºå ç转å½æ´»æ§.为æ¤éè¦ï¼
aãé´å®åæåä¸åºå 表达è°æ§çDNAå
件ï¼
bãå离并é´å®è¿äºé¡ºå¼å
件ç¹å¼æ§ç»åçèç½è´¨å åï¼
è¿äºé®é¢çç 究é½æ¶åå°DNAä¸èç½è´¨ä¹é´çç¸äºä½ç¨.
ç 究DNA-èç½è´¨ç¸äºä½ç¨çå®éªæ¹æ³ä¸»è¦å
æ¬ï¼
aãåè¶é»æ»å®éªï¼ bãDNase 1 足迹å®éªï¼
cãç²åºåå¹²æ°å®éªï¼ dãä½å
足迹å®éªï¼ fãæä¸å®éª.
äºãåè¶é»æ»å®éª
1ãæ¦å¿µï¼
åè¶é»æ»å®éªï¼Gel retardation assayï¼,è¦å«åDNAè¿ç§»çåå¨è¯éªï¼DNA mobility shift assayï¼ææ¡å¸¦é»æ»å®éªï¼Band retardation assayï¼æ¯å¨å
«å年代åæåºç°çç¨äºå¨ä½å¤ç 究DNAä¸èç½è´¨ç¸äºä½ç¨çä¸ç§ç¹æ®çåè¶çµæ³³ææ¯.
2ãåçï¼
å¨åè¶çµæ³³ä¸,ç±äºçµåºçä½ç¨,裸é²çDNAåååæ£çµæ移å¨è·ç¦»ç大å°æ¯åå
¶ååéç对æ°æåæ¯.å¦ææç§DNAååç»åä¸ä¸ç§ç¹æ®çèç½è´¨,é£ä¹ç±äºååéçå 大å®å¨åè¶ä¸çè¿ç§»ä½ç¨ä¾¿ä¼åå°é»æ»,äºæ¯ææ£æ移å¨çè·ç¦»ä¹å°±ç¸åºç缩ç,å èå¨åè¶ä¸åºç°æ»åçæ¡å¸¦,è¿å°±æ¯åè¶é»æ»å®éªçåºæ¬åç.
3ãè¿ç¨:
1)\x09é¦å
å¶å¤ç»èèç½è´¨æåç©ï¼ç论ä¸å
¶ä¸å«ææç§ç¹æ®ç转å½å åï¼
2)\x09ç¨æ¾å°æ§åä½ç´ æ è®°å¾
æ£æµçDNAç段ï¼å«æ转å½å åçç»åä½ç¹ï¼
3)\x09è¿ç§è¢«æ è®°çæ¢éDNAåç»èèç½è´¨æåç©ä¸èµ·è¿è¡æ¸©è²,äºæ¯äº§çDNA-èç½è´¨å¤åç©
4)\x09å¨æ§å¶ä½¿DNA-èç½è´¨ä¿æç»åç¶æçæ¡ä»¶ä¸,è¿è¡éåæ§èä¸ç¯é
°èºåè¶çµæ³³
5)\x09æåè¿è¡æ¾å°èªæ¾å½±,åæçµæ³³ç»æ
4ãå®éªç»æçåæï¼
aãå¦æææ¾å°æ§æ è®°çæ¡å¸¦é½éä¸äºåè¶çåºé¨,è¿å°±è¡¨æå¨ç»èæåç©ä¸ä¸åå¨å¯ä»¥åæ¢éDNAç¸äºç»åç转å½å åèç½è´¨ï¼
bãå¦æå¨åè¶ç顶é¨åºç°æ¾å°æ§æ è®°çæ¡å¸¦,è¿å°±è¡¨æç»èæåç©åå¨å¯ä¸æ¢éDNAç»åç转å½å åèç½è´¨.
5ãDNAç«äºå®éªï¼
DNAç«äºå®éªï¼DNA competitive assayï¼çå
·ä½åæ³å¦ä¸ï¼
å¨DNA-èç½è´¨ç»åçååºä½ç³»ä¸å å
¥äºè¶
éçéæ è®°çç«äºDNAï¼competitor DNAï¼,å¦æå®åæ¢éDNAç»åçæ¯åä¸ç§è½¬å½å åèç½è´¨,é£ä¹ç±äºç«äºDNAä¸æ¢éDNAç¸æ¯æ¯æ大è¶
éç,è¿æ ·ç»å¤§é¨å转å½å åèç½è´¨é½ä¼è¢«ç«äºç»åæ,è使æ¢éDNAä»ç¶å¤äºèªç±çéç»åç¶æ,å¯ä»¥å¨çµæ³³åè¶çæ¾å°èªæ¾å½±å¾çä¸å°±ä¸ä¼åºç°é»æ»çæ¡å¸¦ï¼
å¦æååºä½ç³»ä¸å å
¥çç«äºDNA并ä¸è½åæ¢éDNAç«äºç»ååä¸ç§è½¬å½å å,ç»æå¨çµæ³³åè¶ä¸çæ¾å°èªæ¾å½±å¾çä¸å°±ä¼åºç°é»æ»çæ¡å¸¦.
6ãåºç¨ï¼
aãåè¶é»æ»å®éªå¯ä»¥ç¨äºé´å®å¨ç¹æ®ç±»åç»èèç½è´¨æåç©ä¸,æ¯å¦åå¨è½åæä¸ç¹å®çDNAï¼å«æ转å½å åç»åä½ç¹ï¼ç»åç转å½å åèç½è´¨ï¼
bãDNAç«äºå®éªå¯ä»¥ç¨æ¥æ£æµè½¬å½å åèç½è´¨åDNAç»åç精确åºåé¨ä½ï¼
cãéè¿ç«äºDNAä¸è½¬å½å åç»åä½ç¹ç碱åºçªåå¯ä»¥ç 究æ¤ç§çªåç«äºæ§è½åå
¶è½¬å½å åç»åä½ç¨çå½±åï¼
dãä¹å¯ä»¥å©ç¨DNAåç¹å®è½¬å½å åçç»åä½ç¨éè¿äº²åå±ææ¥å离ç¹å®ç转å½å å.
ä¸ã足迹å®éª
1ãå®ä¹:
足迹å®éªï¼foot-printing assayï¼,æ¯ä¸ç§ç¨æ¥æ£æµè¢«ç¹å®è½¬å½å åèç½è´¨ç¹å¼æ§ç»åçDNAåºåçä½ç½®åå
¶æ ¸è·é
¸åºåç»æçä¸é¨å®éªæ¹æ³.
2ãåçï¼
å½DNAååä¸çæä¸åºæ®µåç¹å¼ç转å½å åç»åä¹å便å¯ä»¥å¾å°ä¿æ¤èå
åDNaseI é
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3è¿ç¨ï¼
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æ£æµçåé¾DNAååå¨ä½å¤ç¨32Pä½5âæ«ç«¯æ è®°,并ç¨éå½çéå¶æ§å
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å¨ä½å¤åç»èèç½è´¨æåç©ï¼ç»èæ ¸æåç©ä¹å¯ä»¥ï¼æ··å,å½¢æDNA-èç½è´¨å¤åä½
å¨ååºæ··åç©ä¸å å
¥å°éçDNase I,并æ§å¶ç¨é使ä¹è¾¾å°å¹³åæ¯æ¡DNAé¾,åªåçä¸æ¬¡ç£·é
¸äºé
¯é®çæè£ï¼
aãå¦æèç½è´¨æåç©ä¸ä¸åå¨ä¸DNAç»åçç¹å®èç½è´¨,使DNase Iæ¶åä¹å,便ä¼äº§çåºè·ç¦»æ¾å°æ§æ è®°æ«ç«¯1ä¸ªæ ¸è·é
¸,2ä¸ªæ ¸è·é
¸,3ä¸ªæ ¸è·é
¸------ççä¸ç³»åååé¿åº¦åç¸å·®ä¸ä¸ªæ ¸è·é
¸çä¸é´æçè¿ç»çDNAç段梯度群ä½ï¼
bãå¦æDNAåååèç½è´¨æåç©ä¸çæç§è½¬å½å åç»å,被ç»åé¨ä½çDNAå°±å¯ä»¥å¾å°ä¿æ¤å
åDNase Ié
¶çé解ä½ç¨ï¼
é¤å»èç½,å æ ·å¨20%åºåè¶ä¸è¿è¡çµæ³³å离,å®éªå两ç»:
aãå®éªç»ï¼DNA+èç½è´¨æ··åç©
bã对ç
§ç»ï¼åªæDNA,æªä¸èç½è´¨æåç©è¿è¡æ¸©è²
æåè¿è¡æ¾å°æ§èªæ¾å½±,åæå®éªç»æ.
4ãç»æå¤æ:
å®éªç»åè¶çµæ³³æ¾ç¤ºçåºå,åºç°ç©ºç½çåºå表ææ¯è½¬å½å åèç½è´¨ç»åé¨ï¼ä¸å¯¹ç
§ç»åºåæ¯è¾,便å¯ä»¥å¾åºèç½è´¨ç»åé¨ä½çDNAåºæ®µç¸åºçæ ¸è·é
¸åºå.
5ãå
¶ä»ç足迹å®éªæ¹æ³ï¼
é¤äºDNase1足迹è¯éªä¹å¤,ç®åè¿åå±åºäºè¥å¹²ç§å
¶ä»ç±»åç足迹å®éª,ä¾å¦ï¼
aã\x09èªç±ç¾åºè¶³è¿¹å®éªï¼bãè²å¯åé足迹å®éªï¼cãDMS(ç¡«é
¸äºç²é
¯)足迹å®éª
DMS(ç¡«é
¸äºç²é
¯)足迹å®éªçåç
DMSè½å¤ä½¿DNAååä¸è£¸é²çé¸åå¤ï¼Gï¼æ®åºç²åºå,èå
æ°¢å¡å¶åä¼å¯¹ç²åºåçGæ®åºä½ç¹å¼æ§çåå¦åå².å¦æDNAååä¸æä¸åºæ®µå转å½å åç»å,å°±å¯ä»¥é¿å
åçGæ®åºçç²åºåèå
åå
æ°¢å¡å¶çåå²ä½ç¨.
åãç²åºåå¹²æ°å®éª
1ãæ¦å¿µï¼
ç²åºåå¹²æ°å®éªï¼Methylation interference assayï¼æ¯æ ¹æ®DMSï¼ç¡«é
¸äºç²é
¯ï¼è½å¤ä½¿DNAååä¸è£¸é²çé¸åå¤ï¼Gï¼æ®åºç²åºå,èå
æ°¢å¡å¶åä¼å¯¹ç²åºåçGæ®åºä½ç¹å¼æ§çåå¦åå²è¿ä¸åç设计çå¦ä¸ç§ç 究èç½è´¨åDNAç¸äºä½ç¨çå®éªæ¹æ³.
åºç¨è¿ç§ææ¯å¯ä»¥æ£æµé¶DNAä¸Gæ®åºçä¼å
ç²åºå,对å°åçèç½è´¨ç»åä½ç¨ç©¶ç«ä¼æä»ä¹æåº,ä»èæ´å 详ç»çæ示åºDNAä¸èç½è´¨ç¸äºä½ç¨ç模å¼.
2ãå®éªæ¥éª¤ï¼
ç¨DMSå¤çé¶DNA使ä¹å±é¨ç²åºåï¼å¹³åæ¯æ¡DNAåªåçä¸ä¸ªG碱åºç²åºåä½ç¨ï¼
åç»èèç½è´¨æåç©ä¸èµ·è¿è¡æ¸©è²,ä¿è¿ä½¿DNAä¸èç½è´¨çç»å
è¿è¡åè¶çµæ³³å½¢æ两ç§é¶DNAæ¡å¸¦ï¼
aã\x09å
¶ä¸æ²¡æåèç½è´¨ç»åçDNAæ£å¸¸çµæ³³æ¡å¸¦
bãå
¶äºåç¹å¼èç½è´¨ç»åèåç°æ»åçDNAçµæ³³æ¡å¸¦
å°è¿ä¸¤ç§DNAçµæ³³æ¡å¸¦åå«ä»åè¶ä¸ååº,并ç¨å
æ°¢å¡å¶è¿è¡åå²,ç»æ为ï¼
aãç²åºåçGæ®åºè¢«åå²:å 为转å½å åèç½è´¨åªè½å¤åæªåçç²åºåçæ£å¸¸çç»åä½ç¹ç»å,æ以å¨è½¬å½å åDNAç»åä½ç¹åºåä¸çGæ®åºå¦æ被DMSç²åºåä¹å,转å½å åå°±æ æ³åå
¶ç»åä½ç¹ï¼é¡ºå¼å
件ï¼åçç»åä½ç¨,ä»è使å¾ç»åä½ç¹ä¸çGæ®åºåæ ·ä¹è¦è¢«å
æ°¢å¡å¶åå²ï¼
bãä¸å
·æç²åºåGæ®åºçé¶DNA åºååä¸ä¼è¢«åå²
å°ç»åèç½è´¨çDNAæ¡å¸¦åä¸ç»åèç½è´¨çDNAæ¡å¸¦,ç»å
æ°¢å¡å¶åå²ä½ç¨ä¹å,åè¿è¡åè¶çµæ³³
ä½æ¾å°èªæ¾å½±,读ç并åæç»æ
3ãç»æå¤æï¼
aãå转å½å åèç½è´¨ç»åçé¶DNAåºå,ç»å
æ°¢å¡å¶åå²ä¹å,çµæ³³å离åç°ä¸¤æ¡å¸¦,æä¸ä¸ªç©ºç½åº
bãä¸å转å½å åèç½è´¨ç»åçé¶DNAåºå,ç»å
æ°¢å¡å¶åå²å,çµæ³³å离åç°ä¸æ¡å¸¦,没æ空ç½åºåçåºç°.
4ãåºç¨ï¼
aãç²åºåå¹²æ°å®éªå¯ä»¥ç¨æ¥ç 究转å½å åä¸DNAç»åä½ç¹ä¸çGæ®åºä¹é´çèç³»ï¼
bãæ¯è¶³è¿¹å®éªçä¸ç§ææçè¡¥å
æ段,å¯ä»¥é´å®è¶³è¿¹å®éªä¸DNAä¸èç½è´¨ç¸äºä½ç¨ç精确ä½ç½®
5ã缺ç¹ï¼
DMSåªè½ä½¿DNAåºåä¸çGåAæ®åºç²åºå,èä¸è½ä½¿TåCæ®åºç²åºå.
äºãä½å
足迹å®éª
ä¸é¢è®¨è®ºçä¸ç§ç 究转å½å åä¸DNAç¸äºä½ç¨çæ¹æ³,æä¸ä¸ªå
±åçä¸è¶³ä¹å¤å¨äºå®ä»¬æ¯å¨ä½å¤è¿è¡çå®éª,å æ¤äººä»¬å°±ä¼èèè¿äºå®éªç»ææ¯å¦è½å¤åæ ç»èå
åçççå®çå½è¿ç¨,å³ç»èå
åçççå®çDNAä¸èç½è´¨çç¸äºä½ç¨æ
åµ.
为äºè§£çè¿ä¸ªé®é¢,ç§å¦å®¶å°±è®¾è®¡åºäºä¸ç§ä½å
足迹è¯éªï¼in vivo foot-printing assayï¼,该æ¹æ³å¯ä»¥çåæ¯ä½å¤DMS足迹å®éªçä¸ä¸ªåç§.
1ãåçï¼
ä½å
足迹è¯éªçåçååä¸åä½å¤DMS足迹å®éªæ æ¬è´¨å·®å«,å³
aãDMSè½å¤ä½¿Gæ®åºç²åºåï¼
bãå
æ°¢å¡å¶è½ç¹å¼çåå²ç²åºåçGæ®åºï¼
cãåç¹å¼è½¬å½å åèç½è´¨ç»åçè¯å«åºåä¸çGæ®åºç±äºåå°èç½è´¨çä¿æ¤èä¸ä¼è¢«DMSç²åºå,äºæ¯ä¸ä¼è¢«å
æ°¢å¡å¶åå²ï¼
dãå对ç
§ç裸é²çDNAå½¢æçåºå梯ä½æ¯è¾,å°±ä¼åç°æ´»ç»èDNAå½¢æçåºå梯ä¸ç¼ºå°Gæ®åºæ²¡æ被åå²çç¸åºæ¡å¸¦.
2ãè¿ç¨ï¼
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çDMSæµåº¦æ°å¥½å¯¼è´å¤©ç¶æè²ä½DNAçGæ®åºåçç²åºå
对è¿äºç»è¿DMSå¤ççç»èæåDNA,并å¨ä½å¤å å
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足迹å®éªä¸ç¨çæ¯ä»æè²ä½DNAä¸å离è·å¾çä»»ä½ä¸ç§ç¹å¼çDNA,å
¶æ°éæ¯å¾®ä¸è¶³éç,æ以éè¦ç»PCRæ©å¢ä»¥è·å¾è¶³å¤æ°éçç¹å¼DNA
æ¾å°èªæ¾å½±,读ç并记å½è¯»ççç»æ
3ãç»æå¤æï¼
aãè½å¤å转å½å åèç½è´¨ç»åçDNAåºæ®µå
¶ä¸Gæ®åºåå°ä¿æ¤å èä¸ä¼è¢«DMSç²åºåé¿å
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æ°¢å¡å¶åå².
å
ãæä¸å®éªï¼Pull-down assayï¼
æä¸å®éªåå«åèç½è´¨ä½å¤ç»åå®éªï¼binding assay in vitroï¼,æ¯ä¸ç§å¨è¯ç®¡ä¸æ£æµèç½è´¨ä¹é´ç¸äºä½ç¨çæ¹æ³.å
¶åºæ¬åçæ¯å°æç§å°è½ï¼ä¾å¦çç©ç´ ã6-Hisæ ç¾ä»¥åè°·è±çè½è½¬ç§»é
¶çï¼çç¼ç åºå ä¸è¯±é¥µèç½çç¼ç åºå éç»,表达为èåèç½.å离纯åèåèç½å¹¶ä¸ç£ç ç»å,使ä¹åºç¸åä¹å,åä¸è¡¨è¾¾ç®çèç½çç»èæåç©æ··åä¿æ¸©éå½æ¶é´,ä¾å¦å¨4âä¸ä¿æ¸©è¿å¤,使ç®æ èç½åå·²ç»åºå®å¨ç£ç 表é¢çèåèç½ä¸ç诱饵èç½å
åçç»å.离å¿æ¶éä¸åºå®åçèåèç½ï¼å³ä¸ç£ç ç¸äºç»åçèåèç½ï¼ä¸ç诱饵èç½ç¸ç»åçç®çèç½,ç»è¿ç
®æ²¸å¤ç使ç®çèç½ä¸è¯±é¥µèç½ç¸è±ç¦»ä»èä»åºç¸æ¯æç©ï¼ä¾å¦ç£ç ï¼ä¸è±ç¦»ä¸æ¥,æ¶éæ ·å,åä¸ç®æ èç½çæä½ä½Western blottingåæ,以æ£æµåºä¸è¯±é¥µèç½çç®æ çç®æ èç½.
æè²è´¨å
ç«å
±æ²æ·ææ¯ï¼ChIPï¼ ããçæ ¸çç©çåºå ç»DNA以æè²è´¨çå½¢å¼åå¨.å æ¤,ç 究èç½è´¨ä¸DNAå¨æè²è´¨ç¯å¢ä¸çç¸äºä½ç¨æ¯éæçæ ¸çç©åºå 表达æºå¶çåºæ¬éå¾.æè²è´¨å
ç«æ²æ·ææ¯ï¼chromatin immunoprecipitation assay, CHIPï¼æ¯ç®åå¯ä¸ç 究ä½å
DNAä¸èç½è´¨ç¸äºä½ç¨çæ¹æ³.å®çåºæ¬åçæ¯å¨æ´»ç»èç¶æä¸åºå®èç½è´¨ï¼DNAå¤åç©,并å°å
¶éæºåæ为ä¸å®é¿åº¦èå´å
çæè²è´¨å°ç段,ç¶åéè¿å
ç«å¦æ¹æ³æ²æ·æ¤å¤åä½,ç¹å¼æ§å°å¯éç®çèç½ç»åçDNAç段,éè¿å¯¹ç®ççæç纯åä¸æ£æµ,ä»èè·å¾èç½è´¨ä¸DNAç¸äºä½ç¨çä¿¡æ¯.CHIPä¸ä»
å¯ä»¥æ£æµä½å
åå¼å åä¸DNAçå¨æä½ç¨,è¿å¯ä»¥ç¨æ¥ç 究ç»èç½çåç§å
±ä»·ä¿®é¥°ä¸åºå 表达çå
³ç³».èä¸,CHIPä¸å
¶ä»æ¹æ³çç»å,æ©å¤§äºå
¶åºç¨èå´ï¼CHIPä¸åºå è¯çç¸ç»å建ç«çCHIP-on-chipæ¹æ³å·²å¹¿æ³ç¨äºç¹å®åå¼å åé¶åºå çé«ééçéï¼CHIPä¸ä½å
足迹æ³ç¸ç»å,ç¨äºå¯»æ¾åå¼å åçä½å
ç»åä½ç¹ï¼RNA-CHIPç¨äºç 究RNAå¨åºå 表达è°æ§ä¸çä½ç¨.ç±æ¤å¯è§,éçCHIPçè¿ä¸æ¥å®å,å®å¿
å°ä¼å¨åºå 表达è°æ§ç 究ä¸åæ¥è¶æ¥è¶éè¦çä½ç¨. ããæè²ä½å
ç«å
±æ²æ·ï¼Chromatin Immunoprecipitation,ChIPï¼æ¯åºäºä½å
åæåå±èµ·æ¥çæ¹æ³,ä¹ç§°ç»åä½ç¹åææ³,å¨è¿å»åå¹´å·²ç»æ为表è§éä¼ ä¿¡æ¯ç 究ç主è¦æ¹æ³.è¿é¡¹ææ¯å¸®å©ç 究è
å¤æå¨ç»èæ ¸ä¸åºå ç»çæä¸ç¹å®ä½ç½®ä¼åºç°ä½ç§ç»èç½ä¿®é¥°.ChIPä¸ä»
å¯ä»¥æ£æµä½å
åå¼å åä¸DNAçå¨æä½ç¨,è¿å¯ä»¥ç¨æ¥ç 究ç»èç½çåç§å
±ä»·ä¿®é¥°ä¸åºå 表达çå
³ç³».è¿å¹´æ¥,è¿ç§ææ¯å¾å°ä¸æçåå±åå®å.éç¨ç»åå¾®éµåææ¯å¨æè²ä½åºå 表达è°æ§åºåæ£æ¥æè²ä½æ´»æ§,æ¯æ·±å
¥åæççãå¿è¡ç®¡ç¾ç
以åä¸å¤®ç¥ç»ç³»ç»ç´ä¹±çç¾ç
ç主è¦ä»£è°¢éè·¯çä¸ç§é常ææçå·¥å
·. ããå®çåçæ¯å¨ä¿æç»èç½åDNAèåçåæ¶,éè¿è¿ç¨å¯¹åºäºä¸ä¸ªç¹å®ç»èç½æ è®°ççç©æä½,æè²è´¨è¢«åæå¾å°ççæ,并æ²æ·ä¸æ¥.IPæ¯å©ç¨æåèç½è´¨åæä½çç¹å¼æ§ç»å以åç»èèç½è´¨çâprorein Aâç¹å¼æ§å°ç»åå°å
ç«çèç½çFCç段çç°è±¡æ´»ç¨å¼ååºæ¥çæ¹æ³.ç®åå¤ç¨ç²¾å¶çprorein Aé¢å
ç»ååºåå¨argaroseçbeadsä¸,使ä¹ä¸å«ææåç溶液åæä½ååºå,beadsä¸çprorein Aå°±è½å¸éæåè¾¾å°ç²¾å¶çç®ç.å®éªæéè¦æ³¨æç¹å°±æ¯æä½çæ§è´¨.æä½ä¸ååæåç»åè½åä¹ä¸å,å
æè½ç»åæªå¿
è½ç¨å¨IPååº.建议ä»ç»æ£æ¥æä½ç说æ书.ç¹å«æ¯å¤æçç¹å¼æ§æ¯é®é¢.å
¶æ¬¡,è¦æ³¨æ溶解æåçç¼å²æ¶²çæ§è´¨.å¤æ°çæåæ¯ç»èææçèç½,ç¹å«æ¯éª¨æ¶èç½,ç¼å²æ¶²å¿
é¡»è¦ä½¿å
¶æº¶è§£.为æ¤,å¿
须使ç¨å«æ强çé¢æ´»æ§åçç¼å²æ¶²,尽管å®æå¯è½å½±åä¸é¨åæåæä½çç»å.å¦ä¸é¢,å¦ç¨å¼±çé¢æ´»æ§å溶解ç»è,å°±ä¸è½å
å溶解ç»èèç½.å³ä¾¿æº¶è§£ä¹äº§çä¸å
¶å®çèç½ç»åçç»æ,æåå³å®æ被å°é,å½±åä¸æä½çç»å,å³ä½¿IPæå,ä¹æ¯å¾å¤èç½ä¸æä½å
±æ²çæ²æ¨ç»æ.å次,为é²æ¢èç½çå解,修饰,溶解æåçç¼å²æ¶²å¿
é¡»å èç½æ¯æå¶å,ä½æ¸©ä¸è¿è¡å®éª.æ¯æ¬¡å®éªä¹å,é¦å
èèæä½/ç¼å²æ¶²çæ¯ä¾.æä½è¿å°å°±ä¸è½æ£åºæå,è¿å¤åå°±ä¸è½æ²éå¨beadsä¸,æ®åå¨ä¸æ¸
.ç¼å²å太å°åä¸è½æº¶è§£æå,è¿å¤åæå被ç¨é. ããChIPçä¸è¬æµç¨ï¼ ããç²éå¤çç»è---æ¶éç»è,è¶
å£°ç ´ç¢---å å
¥ç®çèç½çæä½,ä¸é¶èç½-DNAå¤åç©ç¸äºç»å---å å
¥ProteinA,ç»åæä½-é¶èç½-DNAå¤åç©,并æ²æ·---对æ²æ·ä¸æ¥çå¤åç©è¿è¡æ¸
æ´,é¤å»ä¸äºéç¹å¼æ§ç»å---æ´è±,å¾å°å¯éçé¶èç½-DNAå¤åç©---解交è,纯åå¯éçDNA-çæ---PCRåæ. ããå¨PCRåæè¿ä¸å,æ¯è¾ä¼ ç»çåæ³æ¯åå®é-PCR.ä½æ¯ç°å¨éçè§å
å®éPCRçæ®å,大家ä¹è¶æ¥è¶å¾åäºQ-PCRäº.æ¤å¤è¿æä¸äºç±ChIPè¡çåºæ¥çæ¹æ³.ä¾å¦RIPï¼å
¶å®å°±æ¯ç¨ChIPçæ¹æ³ç 究ç»èå
èç½ä¸RNAçç¸äºç»å,å
·ä½æ¹æ³åChIPå·®ä¸å¤,åªæ¯å®éªè¿ç¨ä¸è¦æ³¨æé²æ¢RNase,æååæçæ¶åéè¦å
å°RNAé转å½æ为cDNAï¼ï¼è¿æChIP-chipï¼å
¶å®å°±æ¯ChIPå¯éå¾å°çDNA-ç段,æ¿å»åè¯çåæ,åæ³å¨ChIPçåºç¡ä¸æææ¹å,ä¸åçå
¬å¸æä¸åçåæ³,è¦æ ¹æ®å
¬å¸çè¦æ±æ¥åå¤æ ·åï¼.
GSTæ²æ·å®éªï¼GST-pull downå®éªï¼ï¼ç»èå¤èç½è´¨ç¸äºä½ç¨ï¼5-11
ä¸é¢æå°,ç¨é
µæ¯åæ交æ¹æ³çéå°çèç½éè¦ä½è¿ä¸æ¥çé´å®.é´å®æ¹æ³ä¹ä¸å°±æ¯ GST
æ²æ·å®éª.GST æ²æ·å®éªä¸»è¦æ¯ç¨æ¥è¯æèç½è´¨èå¤çç¸äºä½ç¨.èç½è´¨å¨èå¤çç¸äºä½ç¨æé¤äºé
µæ¯ç»èå
å¤æä½ç³»çå¹²æ°,æ¯è¾ç´æ¥å°æ£éªèç½è´¨ååä¹é´åå¨çç©ççç¸äºä½ç¨.åé
µæ¯åæ交å®éªä¸æ ·,è¿ç¨æ¤æ³ä¹å¯ä»¥è¯æç¸äºä½ç¨çèç½ååä¸æ¯å¦æåä¸è°èä½ç¨çç»æåæ motif.GST\x09æ²æ·å®éªåçå°±æ¯,æä½ è¦ç 究çèç½åºå äºå
éå°å¸¦æGSTï¼è°·è±çè½è½¬ç§»é
¶ï¼åºå çåæ ¸è¡¨è¾¾è½½ä½ä¸,并å¨ç»èä¸è¡¨è¾¾ GST èåèç½ï¼GST-Xï¼.æ GST èåèç½æå°å¸¦æ GST å°ç©ç Sepharose beads ä¸,ç¶åæå¦ä¸ç§èï¼Yï¼ç½å å
¥å
¶ä¸.ç±äºèç½è´¨ä¹é´çç»åä½ç¨,å½¢æäºè¿æ ·çå¤åç©ï¼GST-X----Y.è¿ä¸å¤åç©ä¸åºä½æ¯æç©ï¼Sepharose beadsï¼å
ç»åå¨ä¸èµ·,å¯ä»¥è¢«æ²æ·ä¸æ¥.æ¤æ³åæå¨ä¸åæ
åµä¸çå
·ä½åºç¨,以ä¸ä¸ä¸ä½ä»ç».
ï¼1ï¼\x09GST èåèç½ä¸éç»èç½çç¸äºä½ç¨
GST èåèç½æ¯å¨åæ ¸è¡¨è¾¾ç,æ以没æç»è¿è¿å¤ç象çæ ¸ç»èå
å
·æçèç½ä¿®é¥°ä½ç¨.
æ以å¦ä¸ç§ç¨æ¥æ£éªç¸äºä½ç¨çèç½ä¹å¯ä»¥ç¨åæ ¸è¡¨è¾¾åºæ¥,ä¹å°±æ¯æè°çéç»èç½.å½ GSTèåèç½æéç»èç½æ²æ·ä¸æ¥,ç¶åç¨éç»èç½çæä½ä½ Western blotting æ£æµ.
ï¼2ï¼ GST èåèç½ä¸ä½å¤ TNT ç³»ç»åæçå¤è½æèç½çç¸äºä½ç¨
ç¨æ¥æ£éªä¸GSTèåèç½ç¸äºä½ç¨çèç½æå¤è½ä¹å¯ä»¥ç¨TNTä½å¤èç½åæä½ç³»è¿è¡å
æ,并ä¸è¿å¯ä»¥å¨è¦åæçèç½æå¤è½N端æC端å ä¸ä¾¿äºæ£æµçæ ç¾.GSTèåèç½æ²æ·ä¸æ¥çèç½æå¤è½å¯ä»¥ç¨è¯¥èç½æå¤è½çæä½ææ ç¾æä½è¿è¡Western blottingæ£æµ.å¦æèç½ä¹é´ç»ååé常弱,ç¨Western blottingæ£æµæ¹æ³é¾ä»¥æ£æµå°,ä½ å¯ä»¥å¨TNTä½å¤åææ¶ç»èç½è¿è¡åä½ç´ ï¼S32ï¼æ è®°.è¿æ ·æ²æ·ä¸æ¥çèç½è¿è¡æ¾å°èªæ¾å½±,æ£æµçµæ度å°æ大æé«.
ï¼3ï¼ GST èåèç½ä¸ç»èå
æºæ§èç½è´¨çç¸äºä½ç¨
GSTèåèç½è¿å¯ä»¥æç»èæåç©ä¸æç¸äºä½ç¨çå
æºæ§èç½è´¨æ²æ·ä¸æ¥.å¦æå
æºæ§è
ç½å«éä½æç»ååå¼±,å¯ä»¥éç¨èå²æ³ä½¿ç»èå¨æä¸æ®µæ¶é´å
åæçææèç½è´¨é½æ è®°ä¸æ¾å°æ§åä½ç´ ï¼S32ï¼,ç¶åæåç»èæ»èç½ä¸GSTèåèç½æ¸©è².GSTèåèç½æ²æ·ä¸ç带ææ¾å°æ§æ è®°çèç½è·çµæ³³,è¿è¡æ¾å°èªæ¾å½±.
ï¼4ï¼ GST èåèç½ä¸ç»èå
ç¬æ¶è¡¨è¾¾çèç½è´¨çç¸äºä½ç¨
å½å
æºæ§èç½è´¨å«éä½,并ä¸æå¯è½å½±åèç½è´¨çç¸äºä½ç¨,ä¹å¯ä»¥æ该èç½çåºå 转æ
å°é¶ç»èå
è¿è¡è¿è¡¨è¾¾,ç¶åæ£éªèç½è´¨ç¸äºä½ç¨.
ï¼5ï¼ GST èåèç½ä¸å¾
æµèç½çç¸äºä½ç¨æå¯è½ä¸å¾
æµèç½ç磷é
¸åç¶ææå
³å¨è¿è¡ GST æ²æ·å®éªæ¶,ææ¶ä¹ä¼éå°æ¯è¾å¤æçæ
åµ,å
·ä½æ
åµå
·ä½åæ,åå«å¯¹å¾
.æ¯å¦,两个èç½è´¨ä¹é´åçç¸äºä½ç¨æ¶æå¯è½ä¸èç½ç£·é
¸åç¶ææå
³.æè
èç½é¦å
被磷é
¸ååæ¹è½äº§çç¸äºä½ç¨,æè
磷é
¸åçèç½å¿
éè±ç£·é
¸ååæè½äº§çç¸äºä½ç¨.å¦æä½ ç¡®å®å¨ä½
çå®éªä¸åç°äºå
¶ä¸ä¸ç§æ
åµ,è¿å°æ¯ä¸ä¸ªé常ææä¹çç»æ.
3,\x09å
ç«å
±æ²æ·ï¼co-immunoprecipitation ï¼ï¼ç»èå
èç½è´¨ç¸äºä½ç¨ï¼9-16
å
ç«å
±æ²æ·ææ¯ç¨æ¥è¯æèç½è´¨å¨èå
æ¯å¦æç¸äºä½ç¨.ä¸è¬æ¥è¯´,两ç§èç½å¨ç»èå
å
çç¸äºä½ç¨æ¶ä¼å½¢æ两ç§èç½çå¤åç©,è¿æ ·å°±å¯ä»¥å
ç¨ä¸ç§èç½çæä½æå
ç«å¤åç©æ²æ·ä¸æ¥,ç¶åç¨å¦ä¸ç§èç½çæä½è¿è¡ Western blotting æ£æµ,ç两ç§èç½ä¹é´æ¯å¦ç¡®å®å½¢æå
ç«å¤åç©,并è½ä¸ protein A/G agarose ä¸èµ·æ²æ·ä¸æ¥.å
ç«å
±æ²æ·åçç®å,ä½ææ¯æ为å¤æ.å 为ç»èå
èç½ç§ç±»ç¹å¤,å¶çº¦å ç´ å¤.å¦æ两ç§èç½ä¹é´å¯ä»¥åçç¸äºä½ç¨,并ä¸æ¯è¿ä¸¤ç§èç½ææååé½åä¸ç»åä½ç¨,ä¹å¯è½åªææå°é¨åèç½ååç»åå¨ä¸èµ·ï¼è¶³ä»¥æ»¡è¶³ç»èåè½éè¦ï¼.å¨æåç»èèç½æ¶,å¦ææ¡ä»¶ä¸å½å°±ä¼ç ´å两ç§ç¸äºä½ç¨èç½å½¢æçå¤åç©ç稳å®æ§,使å¾å
ç«å
±æ²æ·å®éªå¤±è´¥.å¦æ两ç§èç½å¨ç»èå
çç»ååç¡®å®é常弱,é£ä¹å
ç«å
±æ²æ·ä¹é¾ä»¥æå.å¦æç¥éåçç¸äºä½ç¨ç两个èç½é½æ¯èæ ¸èç½,é£ä¹å¯ä»¥éè¿æåæ ¸èç½,åè¿è¡å
ç«å
±æ²æ·å®éª,è¿æ ·ä¼å¤§å¤§åä½èæ¯çå¹²æ°.å
³äºä¸¤ç§èç½è´¨ä¹é´èå
çç¸äºä½ç¨,ææ¶ç¡®å®æ æ³ç¨å
ç«å
±æ²æ·å®éªè¯æ.
ï¼1ï¼ ç»èå
è¿è¡¨è¾¾èç½çå
ç«å
±æ²æ·
è¯æèç½è´¨èå
ç¸äºä½ç¨æ¶,å¯ä»¥éæ©ä¸ä¸ªé«æç¬æ¶è¿è¡¨è¾¾ç³»ç»ï¼è³äºè¿ä¸ç³»ç»æ¯å¦æå
æºæ§é¶èç½æ å
³ç´§è¦ï¼.ä¸è¬éå COS ç»èä½ä¸ºçæ ¸è¡¨è¾¾æ ª.æ两ç§èç½åºå å
±è½¬æå° COS ç»èå
è¿è¡è¡¨è¾¾.ç±äºäººä¸ºè¿è¡å¤§é表达,æ以å¨èå
两ç§èç½å½¢æç¸äºä½ç¨çå¤åç©çéä¹ç¸åºå¢å¤.å¦æä½ æ头没æè¿ä¸¤ç§èç½çæä½,å¯ä»¥æè¿ä¸¤ç§èç½çä¸ç«¯åå«å ä¸æ ç¾ä»¥èåèç½å½¢å¼è¡¨è¾¾,ç¶åç¨åä¸åçææ ç¾æä½è¿è¡å
ç«å
±æ²æ·å Western blotting æ£æµ.
ï¼2ï¼ ç»èå
æºæ§èç½çå
ç«å
±æ²æ·
æ两ç§èç½å
±è½¬æå° COS ç»èå
è¿è¡è¿è¡¨è¾¾,è¿è¡å
ç«å
±æ²æ·å®éª,ç¸å¯¹å®¹ææå,ä½æ¯
è¿ä¸ç»ææ¯ç«å
·æ人工æ§,ä¸è½ä»£è¡¨ççæ¡ä»¶ä¸çå®çèç½è´¨ç¸äºä½ç¨.è¦æ³å
æè¿ä¸å¼±ç¹,
å¯ä»¥åå
æºæ§çå
ç«å
±æ²æ·å®éª.è¿ä¸ææ¯è¦æ±æé«,é¾åº¦æ大,ä½ä¹ææ说æå.å 为ç»èå
å
æºæ§èç½å«éä½,ç»åå¨ä¸èµ·å½¢æå¤åç©çéæ´ä½,é¾ä»¥æ£æµ.é¦å
è¦è¯ææéæ©çç»èç³»æ¯å¦å
·æè¿ä¸¤ç§å
æºæ§çèç½.å¦å¤,ç¨äºå
ç«æ²æ·å Western blotting æ£æµçæä½è¦å¥½.ç»èè£è§£ãæ¶é以åå
ç«æ²æ·æ¶æ¶æ¡ä»¶è¦æ¸©å,以ä¿æèç½å¤åç©ç天ç¶ç»æ.
ï¼3ï¼ ç»ç»å
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»ç»è,ç¶åå¶å¤ç»èæåç©,åå
æºæ§å
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±æ²æ·.ç±æ¤å¯ä»¥æ¨å¹¿å°å
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å
ç«å
±æ²æ·.åå¨ç©ç»ç»ï¼èãèãè¾çï¼,åç¢,åæµ,æåç»ç»èç½,è¿è¡å
ç«å
±æ²æ·å®éª.è¿ä¸ç»æ代表活ä½ä¸èç½è´¨ç¸äºä½ç¨.
4,\x09èç½è´¨ç»èå
å®ä½å®éª17-22
å¦ä¸ç§ç»å¸¸ç¨æ¥æ£éªèç½è´¨ç¸äºä½ç¨çæ¹æ³æ¯èç½è´¨ç»èå
å®ä½ææ¯.æ¤æ³è¾ä¸ºç´è§,å¯
以çå°ä¸¤ç§æç¸äºä½ç¨çèç½è´¨å¨ç»èå
çåå¸ï¼èä¸ãèæµãèæ ¸æå
¶å®ç»èå¨ççï¼ä»¥åå
±å®ä½çé¨ä½ï¼å¨èä¸å
±å®ä½ãå¨èæµä¸æä¸é¨ä½ææ ¸å
å
±å®ä½ççï¼.ææ¶ç¸äºä½ç¨çèç½ç±äºç»èå
æç§åè½çéè¦ç»åå¨ä¸èµ·æ¶,使å¾ä¸¤ç§èç½çåå¸åçåå.æ¯å¦,æç§èç½ä¹è®¸å¨æ ¸å
,å½å®ä¸å¦ä¸ç§å
·æç©¿æ¢åè½çèç½ç»åæ¶,æå¯è½è¢«è½¬è¿å°èæµä¸.è¿ç§æ
åµçå
±å®ä½åè¾ä¸ºå
¸å.å¨è¿è¡èç½è´¨å
±å®ä½
ï¼1ï¼ å©ç¨æè²è§å
èç½æ è®°ææ¯è¿è¡èç½å®ä½ç 究
æ¤æ³ä¹å¯ç§°ä¸ºæ´»ç»èå®ä½.æ两ç§å
·æç¸äºä½ç¨çèç½åå«å
éå°å¸¦æ两ç§ä¸åé¢è²è§å
èç½ï¼ç»¿è²è§å
èç½æ红è²è§å
èç½ï¼çè½½ä½ä¸,å
±è½¬æå°åè½ç»èä¸ï¼ä¸è¬éç¨ COS7 ç»èï¼è¡¨è¾¾å¸¦æè§å
çèåèç½.è¿æ ·,ç¸äºä½ç¨ç两ç§èç½å°±è¢«æ ä¸ä¸åçè§å
,å¯ä»¥å¨ç»èå
ç¨è§å
æ¾å¾®éç´æ¥è§æµ.å¨è¿è¡ç²¾ç¡®ç»èå®ä½æå
±å®ä½æ¶,å¿
é¡»ç¨å
±èç¦è§å
æ¾å¾®éè§æµ.å 为å
±èç¦è§å
æ¾å¾®éï¼ç¸å½äºå»é¢ç»ç
人è¯æç CTï¼è§æµçæ¯ç»èå
ä¸ä¸ªåé¢ä¸çé¢è².å¦æå¨ä¸ä¸ªåé¢ä¸å¨åä¸åºåçå°ä¸¤ç§é¢è²,å°±æ示è¿ä¸¤ç§èç½å¨è¯¥åºåå
æç¸äºä½ç¨.æ®éè§å
æ¾å¾®éçå°çæ¯ä¸ä¸ªç«ä½å¾è±¡,æ æ³ç¡®å®èç½è´¨å
±å®ä½ç°è±¡.å¨è¿è¡å®ä½æå
±å®ä½åæ¶,ä¹å¯ä»¥å¯¹ç»èæ ¸è¿è¡æè².è¿æ ·,å¨ç»èä¸å°±æä¸ç§é¢è².ç»èæ ¸çæ¾è²å¸®å©ä½ ç¡®å®å
±å®ä½åççä½ç½®.ä¸é¢ä»ç»çæ´»ç»èå®ä½,å
¶ä¼ç¹æ¯è¡¨è¾¾çè§å
èç½è§å
强,没æèæ¯,è§æµæ¹ä¾¿.ä½ç¼ºç¹
æ¯ç¸äºä½ç¨çèç½ç±äºæ ä¸è§å
èç½,å®é
ä¸æ¯ä¸¤ä¸ªèåèç½.èåèç½çå®ä½ç»ææå
±å®ä½ç»ææ¯å¦ä¸å¤©ç¶èç½åå¸ä¸è´,æå¾
äºè¿ä¸æ¥ç¡®å®.èå©ç¨å
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è¿ä¸ç¼ºç¹.
ï¼2ï¼ å©ç¨åè²æå¤è²æè²çå
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å
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æç»èè¿è¡åºå®,ç¶åç¨å¾
æ£æµé¶èç½çæä½ï¼ä¸æï¼ä¸ç»èå
é¶èç½è¿è¡å
ç«ååº,åç¨è§å
ç´ ï¼å¦ FITC å TRITC çï¼æ è®°çäºæä¸ä¸æè¿è¡ååº.è¿æ ·å°±å¨ç»èå
å½¢æå
ç«å¤åç©ï¼é¶èç½----ä¸æ---äºæï¼,ç»æé¶èç½è¢«æ ä¸é¢è²,ç¶åå¯ç¨å
±èç¦è§å
æ¾å¾®éè§æµå®ä½ä¸å
±å®ä½ç»æ.
å
ç«è§å
ææ¯æ大ä¼ç¹å°±æ¯å¯ç¨æ¥æ£æµç»èå
æºæ§èç½çå®ä½åç¸äºä½ç¨.å½ç¶ä¹å¯ä»¥å¯¹
é¶ç»èè¿è¡è½¬æ表达ç®çèç½,ç¶åæ è®°ç®çèç½è¿è¡è§æµ.å
ç«è§å
ææ¯ç缺ç¹æ¯è§å
ç¸å¯¹è¾å¼±å¹¶ä¸èæ¯è¾é«,ç»æåå°å¹²æ°,æ以è¿é¡¹ææ¯ä¸å¥½ææ¡.为äºç»æçå¯é æ§,è¦æ±ä¸¥æ ¼è®¾è®¡é³æ§å¯¹ç
§ä¸é´æ§å¯¹ç
§.
ï¼3ï¼ ç»èå
èç½å¨æå®ä½
ææ¶ç»èå¨æ£å¸¸ç¶æä¸,æç¸äºä½ç¨çèç½å¨èå
å¯è½ææ¶åå¼,没æå
±å®ä½ç°è±¡åç.
ä½æ¯å¨æä¸ä¸ªç¹å®æ
åµä¸,å¦ç»èåå°å¤çåºæ¿æ¶,ç»èæ¬èº«ä¼äº§çåºæ¥ååº,è¿æ¶ææ¶å离çèç½æå¯è½åçç¸äºä½ç¨,并产çå
±å®ä½ç°è±¡.æ以å¨è¿è¡å
±å®ä½ç 究æ¶,å¯æ ¹æ®å
·ä½æ
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è¦æ¶è§æµç»èå
èç½å¨æå®ä½ç»æ.
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