PCR(聚合酶链式反应,Polymerase Chain Reaction)是一种常用的分子生物学技术,其目的是在体外复制特定的DNA片段,从而使之数量显著增加。PCR反应的原理可以分为以下几个步骤:
初始化(Denaturation):PCR反应的第一步通常在较高的温度下进行(通常约94-95°C),在这个温度下,双链DNA会解链成为两条单链。
退火(Annealing):在降低的温度下(通常约50-65°C),特异的引物(primer)会结合(退火)到目标DNA的互补序列上。每个引物都设计成与目标DNA的一侧(上游或下游)相匹配。
延伸(Extension/Elongation):在较高的温度下(通常约72°C,这是一般用于PCR的Taq DNA聚合酶的最佳活性温度),DNA聚合酶从引物开始沿着模板链合成新的DNA链。在这个过程中,每个单链DNA都复制成为两个双链DNA。
这些步骤在一个PCR反应中会进行多轮(通常30-40轮),每轮都会使目标DNA片段的数量翻倍。这样,经过数轮PCR,你就可以从一个非常小的样本中获取大量的目标DNA片段。
PCR是现代生物学和医学的重要工具,被广泛用于基因克隆、基因编辑、疾病诊断(包括对某病毒的检测)和法医学等领域。
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变性:加热使模板DNA在高温下(94℃左右)双链间的氢键断裂而形成两条单链。
退火;使溶液温度降至50~60℃,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合。
延伸:溶液反应温度升至72℃,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物的引导下,利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP),按5'一3’方向复制出互补DNA。
扩展资料
PCR反应五要素:参加PCR反应的物质主要有五种即:引物(PCR引物为DNA片段,细胞内DNA复制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg离子)。
引物有多种设计方法,由PCR在实验中的目的决定,但基本原则相同。PCR所用的酶主要有两种来源:Taq和Pfu,分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择。
模板即扩增用的DNA,可以是任何来源,但有两个原则,第一纯度必须较高,第二浓度不能太高以免抑制。
缓冲液的成分最为复杂,除水外一般包括四个有效成分:缓冲体系,一般使用HEPES或MOPS缓冲体系;一价阳离子,一般采用钾离子,但在特殊情况下也可使用铵根离子。
二价阳离子,即镁离子,根据反应体系确定,除特殊情况外不需调整;辅助成分,常见的有DMSO、甘油等,主要用来保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构。
参考资料来源:百度百科-PCR技术
参考资料来源:百度百科-聚合酶链式反应