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Takara双酶切体系
takara
公司的EcoR1和Not1 50μl
双酶切
反应
体系
的配制?
答:
酶各加1.5 ul,底物加入在2ug,37℃,1*H Buffer+BSA,
酶切
12小时。
Takara
的NheI 和BamHI
双酶切体系
表中没有双酶切缓冲体系应该如何选用缓 ...
答:
1、如果你用的是
Takara
的
酶
,应该就只能分步了,而且BamHI还是30度反应,虽然也可以在37度切,但如果是分步切的话还是用30度吧。2、为什么不用NEB的酶呢?可以用buffer1或2同时切(好像是,你需要自己再确认下),而且NEB的这两种酶都有HF酶,效率更高,都可以在buffer4中达到100%的效率。以上,...
...如何确定?最好是说明原理。所用的
酶
都是
Takara
公司的
答:
buffer 去
Takara
产品目录查
双酶切
buffer表,按照那个倍数加,有时候需要BSA 水补足 20ul 30或37度,1-5小时都可以。有个别酶需要55度。注意,酶别加多了,甘油浓度过高影响酶的活性。反应
体系
中甘油浓度要小于1%,而酶是储存在50%甘油中。
用
Takara
的BamH 1和Xho 1做同步
双酶切
,但是BamH 1的最佳温度是30℃而X...
答:
1. BamHI和XhoI都是常用酶,比较便宜,可以换一家公司买。至少Fermentas和NEB的BamHI都是37度的。2. 分布
酶切
。单酶切,跑胶回收,再另一个单酶切。这要求你的DNA template多一点,比如质粒或者PCR产物。
双酶切
的连接反应
答:
应用大
体系
,如100微升。纯化问题:纯化PCR产物割胶还是柱式,我推荐柱式,因为割胶手法不准,很容易割下大块的胶,影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物,既然如此,酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以,PCR产物和
双酶切
产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是
TAKARA
的纯化柱试剂盒酶量的...
(实例)
酶切
位点选择与阅读框的调整
答:
之后在剩下的酶切位点中,选择常用的即可,因为HindIII、EcoRI两个酶切位点靠的太近,没有选择这两个的组合,以免造成双酶切的效率下降。因此,最终选择的是EcoRI+KpnI的酶切组合。同时,发现EcoRI酶和KpnI酶的最佳NEB反应缓冲液不一样,查看EcoRI酶和KpnI酶的
TAKARA双酶切体系
,推荐使用TAKARA的M...
Xho1和Nde1 50μl
双酶切
反应
体系
的配制??
答:
由这两种酶组成的
双酶切体系
并不需要添加BSA,请你仔细核对,两种酶的最适反应温度均为37摄氏度所以双酶切温度应为37摄氏度。如果选用
TaKaRa
的限制性内切酶那么Buffer应使用H Buffer,对于50 μl的酶切体系而言应分别加入1.5 μl的Xho1和Nde1并且加入5 μl的10×H Buffer(使得酶切体系中的Buffer...
用
Takara
的BamH 1和Xho 1做同步
双酶切
,但是BamH 1的最佳温度是30℃而X...
答:
我看了下说明 BamH1在37°也可以
切
只是没30°稳定 所要你要么就依次切 要么就37°切
两种酶的反应缓冲液不一样,做
双酶切
时如何处理?
答:
如果是分开
酶切
的话,第一个酶切完成后要回收(可用醇回收,效率比较高)后,再进行第二次酶切。做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见,一般连接3小时,16度;对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来...
用
TaKaRa
的Bln1和Sal1做
双酶切
,用的M buffer
答:
嗯,需要分开
酶切
1
2
3
涓嬩竴椤
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