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阳性克隆PCR验证方法
pcr
的关键性技术
答:
引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行
PCR
扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假
阳性
。需重新设计引物。 靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下
方法
解决:操作时应小心轻柔,...
怎样
克隆
启动子和测定其序列?步骤尽量说详细点
答:
PCR克隆
,根据自己合成的槽式引物和genomic walking的模板末端加上的接头序列,PCR(一般都是用Touch DownPCR,根据槽式引物,扩增两轮,第二轮是以第一轮的PCR产物为模板);点样检测,挖胶回收特异的条带;TA克隆,选择
阳性克隆
测序。一般启动子的长度超过1K就可以了。一次长度不够,可以根据测出来的...
RACE
PCR验证
基因特异性引物的对照
答:
在进行RACE
PCR验证
基因特异性引物时,阴性对照是一个关键步骤。首先,仅使用一个特定的引物GSP进行实验,理想的预期结果是不应观察到任何条带。如果检测到产物,应检查循环参数或重新设计引物,以确保其特异性。为了验证目的基因的表达,
阳性
对照非常重要。当你使用两个GSP(确保它们能产生重叠区域),结合...
免疫
PCR
的基本原理和大致流程是什么
答:
从而将对蛋白质的检测转变为对核酸的检测.最初Sano等人建立的免疫 -
PCR
实验流程如下:(1)再包被缓冲液稀释抗原BSSA,并固定在微滴定板上.(2)微滴定板上加入相应的已稀释的单
克隆
抗体,并洗去未结合的抗体分 子.(3)加入稀释的已与生物素化PUC19的结合的链亲和素-蛋白A嵌合体(蛋白A能与抗体...
菌落
pcr
检测
阳性
转化菌时为什么会出现假阳性
答:
这样会大大降低假阳性;如果你用目的基因本身引物做菌落
PCR
,挑菌时一定要小心不要沾到培养基(里面有大量的未连接的片段),然后PCR扩增的循环数要少(<25),做好阴性对照(在平板上没有斑的地方挑一下),跑出亮亮的目的片段才是真的
阳性克隆
...
菌落
PCR
的具体
方法
答:
3、将混有菌体的
PCR
混合物置于PCR仪中,按常规条件扩增。4、在扩增出来的反应液中加入溴酚蓝或是其他染料,电泳检测是否得到目的片断。如有则为
阳性克隆
。5、将已经筛选到的阳性克隆对应96孔反应板上的菌株挑选出来,37度继续培养达到一定时间可以抽提质粒,测序
验证
是否是需要的目的基因注意事项:设计...
阳性克隆
过程中筛选的目的
答:
将载体转入大肠杆菌,在含有Amp的培养基上培养,蓝白斑筛选
阳性克隆
,再提取质粒DNA,
PCR
检测就可以了。
PCR
实验室的建立
方法
答:
2、样品准备和RNA-
PCR
RNA-PCR的额外步骤需要额外的样品操作,这样增加了样品之间污染的机会。为了避免这一问题,反转录一步可以在样品准备区进行。在RNA-PCR中应用UNG以防止污染的
方法
也有报道。3、建立前PCR区。该去专门用于准备各种反应,这个区域必须保持干净,而且没有来自
克隆
和样品准备的污染。前PCR...
几种
PCR
区别及引物问题求教
答:
菌落
PCR
,通过 PCR 手段来迅速筛选
阳性克隆
子。使用灭菌的牙签将菌落直接挑到反应混合液中,通过 PCR 预变性步骤的高温使细菌的基因组释放作为 PCR 反应的模板。菌落 PCR 中使用的引物定位在插入位点外侧的载体区,因此尽管插入的序列各不相同,也不影响扩增反应的进行。 RT-PCR(Reverse Transcription PCR):逆转录 PCR...
手工法 革兰阴性菌总DNA提取模板做
PCR
经验
方法
答:
如果你有96孔深板(1-2ml)以及排枪最好了,省事省时。牙签或者枪头挑菌挑一点点(只要沾到菌落就行,不要求大块,大块反而不好),96孔每孔加500ul培养液,挑96个,然后拿去摇菌,培养3-5小时,菌液就可以直接作为
pcr
的模板了。只要引物好用,基本都可以扩出来的。我们鉴定
阳性克隆
都这样做,你...
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