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阳性克隆PCR验证方法
如何构建一个基因的过表达载体
答:
当拿到一个基因的DNA片段后,就需要把它导入一个载体,一方面长期保存。另一方面也需要以载体为媒介将基因导入受体细胞中。基因表达载体的构建是基因工程的核心。常用的载体有细菌质粒,噬菌体和动植物病毒。其中质粒载体最常用。所谓载就是一个很长的环状DNA,携带一些基因,可以导入细菌中自我复制,也可以...
关于
克隆
答:
目前,生产哺乳动物
克隆
的
方法
主要有胚胎分割和细胞核移植两种。克隆羊“多莉”,以及其后各国科学家培育的各种克隆动物,采用的都是细胞核移植技术。所谓细胞核移植,是指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核,经显微手术和细胞融合方法移植到去核卵母细胞中,重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。与胚胎分割技术不同,...
(万分火急)转化子的菌落
PCR
原理是什么?
答:
如果转化成功的话,菌落里的菌就含有你
克隆
的质粒载体了,用枪头直接碰一下,然后作为
PCR
模板,就可以进行PCR扩增了。但是菌落PCR鉴定的假
阳性
率其实也不低,所以建议你挑取菌落扩培之后抽提质粒,进行酶切鉴定,这样比较准确,酶切鉴定确认好之后再去测序以确定没有碱基突变或缺失。你说的T7通用引物是指...
通过RT-
PCR
和RACE 法为什么可以分离出基因
答:
以此筛选出
阳性克隆
,进行序列分析,以获得 cDNA 全长。该方法能避免
PCR
扩增的非特异性扩增或错配,是一种比较准确可靠的 cDNA
克隆方法
。主要缺点是克隆过程需要一系列的酶促反应、产率低、费时长、工作量大。该方法适合于表达丰度高的基因的筛选分离。用于做标记探针的 DNA 片段可以是其它生物的...
图位
克隆
法的图位克隆的技术环节
答:
另一重要的基于
PCR
的策略是A1u-PCR技术,该技术利用人类基因组的Alu重复序列,合成一对特异性引物,进行PCR扩增,然后以PCR产物为探针,从文库中筛选出
阳性克隆
。这一
方法
简便,但有时会出现一些误差,当与限制性内切酶物理图谱结合使用时,就可以比较精确地排列出阳性克隆的重叠顺序。3)DNA指纹—锚标法。其原理是首先对...
定位
克隆
的筛选
方法
答:
此外,其它
方法
还很多,如微切割和微
克隆
法、减法cDNA杂交法、重组筛选法等。 依赖特征序列的方法是依据转录子内部及其两侧的序列特征直接从基因组DNA中分离cDNA片段,主要有CpG岛搜寻法、外显子捕获法(exontrapping)、交叉物种序列同源性比较法(cross-speciessequencehomology)、Alu
PCR
法与直接序列分析法等。
很想知道质粒构建的详细步骤?
答:
酶切后的产物也要进行回收 3. 连接 通过连接酶将酶切后的
PCR
产物和质粒载体进行连接 4. 转化 将连接产物转化到受体菌中(一般为DH5a),涂板,培养过夜 5. 挑取单克隆,并鉴定 挑去平板上的单克隆培养,可以通过PCR或者酶切初步鉴定
阳性克隆
,对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序 ...
荧光素酶报告基因的技术流程
答:
(1) 用生物信息学
方法
分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。(2)设计引物用
PCR
法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段,将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒(pGL3-basic)中。(3)筛选
阳性克隆
,测序。扩增克隆并提纯质粒备用。(4) 扩增转录因子质粒,提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照...
转基因棉花的实验流程
答:
(1)首先要设计带特定酶切位点的引物,
PCR
扩增含目的基因的cDNA样品进行基因克隆;(2)其次,目的基因片段和克隆载体分别进行双酶切并回收,电泳检测,吸光度测定浓度;(3)第三,载体连接并转化大肠杆菌,挑选
阳性克隆
;(4)第四,提取质粒,电泳检测,吸光度测定浓度;(5)第五,转化。可以直接用...
...总出现假
阳性
的
克隆
,菌液
PCR
检测不到目的片段却可以检测到GUS片段...
答:
我想这是因为你的启动子检测载体设计的不合理造成的,你可以在启动子前而加一个转录终止子,以阻止这种假
阳性
信号。还有一个原因是:如果是原核生物,启动子本来就只有几十甚至十几个bp,
PCR
检测不到很正常。
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