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防止载体自连有哪些方法
为什么碱性磷酸酶处理可以
防止
质粒
载体
DNA
自连
的作用
答:
碱性磷酸酶可以去除DNA断裂处的5'端的磷酸基团
。5'端的磷酸基团对于DNA连接是必须的,用碱性磷酸酶处理切开的载体后,载体不能在DNA连接酶的作用下自连,而目的基因片段两端是有5'端的磷酸基团的,可以在DNA连接酶的作用下与载体连接。所以碱性磷酸酶处理可以防止质粒载体DNA自连的作用。 本回答由提问者推荐 举报| ...
再次请教生物问题
答:
载体自连最容易发生的情况有两种,
一种是单酶切,一种是平末端连接
。这两种情况下,通常为了防止载体自连会
对酶切后的载体使用碱性磷酸酶处理
,将DNA 5‘端的-P基团置换成-OH,这样会一定程度的防止载体自连。
...单酶切后 怎么把目的基因连到已经酶切过的
载体
上 如何
防止自连
...
答:
单酶切要想防止自连,
最好的办法是把载体酶切产物脱磷酸
。脱了磷酸的载体就无法自连,它只能和目的片段连接。如果不想脱磷,可以在连接反应体系中加大目的片段的数量,提高阳性克隆的比例,但这不能完全避免自连。不过最好的办法还是
做双酶切
。单酶切连接实在麻烦。
如何避免载体自连
现象
答:
碱性磷酸酶处理切开的载体
~可减少自连的产生~再一点双酶切要充分~可先做一个小切的预实验~
关于碱性磷酸酶CIAP的使用
答:
减压干燥就是用减压干燥器对微量生物样品进行干燥。常用的就是Eppendorf的concentrator系列减压干燥器。不减压靠室温干燥时间过长。你胶回收的时候你要的带的DNA量你可以估计一下,然后换算成摩尔数,加
载体
的时候也计算一下
载体
的量,二者5:1比例以上混合后连接。
都
有哪几种方法避免载体
质粒的自环化?
答:
具体可采用以下方法:(1)用
碱性磷酸酶处理
限制酶酶解产生的线性载体分子。碱性磷酸酶可除去线性载体DNA 分子的5¹-磷酸,而留下3¹-羟基基团。经过碱性磷酸酶处理的线性载体分子,除非插入外源DNA 片段,否则就不能重新环化为有功能的载体分子。(2)采用同聚物加尾连接技术,可自动防止线性...
【求助/交流】平末端必须去磷酸化吗
答:
!!chenliang_0513(站内联系TA)肯定是没有必要的ben1147(站内联系TA)在载体两端都是平末端的时候,去磷酸化
防止载体自连
如果一端平,一端粘性末端的话就不用,因为不会自连 在载体两端都是平末端的时候,去磷酸化防止载体自连
载体
和目的基因分别经限制性酶切后,产生不同的3'突出粘性末端。设计实验...
答:
方法非常多,列举一两个:1.不同的粘性末端不能相连。所以,如果要相连,就要去除不同的粘性末端,进行平末端相连。粘末端变成平末端有两种方法:klenow酶的补平或者s1核酸酶的切平。为了减少载体自连,
可以用碱性磷酸酶处理载体
。最后将载体和目的基因链接,构建重组质粒。2.设计引物,自带酶切位点,...
...检外源DNA其优点可以
防止
质粒和含同的基因的外源DNA片段自身环化_百...
答:
每种限制性内切酶的酶切位点是不一样的,因此,不同的酶切位点不能连到一起,相同的才可以。用不同的切,到连接的时候,可以有效
防止载体自连
,只能让外源DNA片段和载体之间那相同的酶切位点相互连接。
胶回收及目的基因与t
载体连接
反应中为什么要有对照?
答:
连接反应中一般要设置阴性对照和阳性对照。设置阴性对照是为了
防止载体自连
,设置阳性对照是为了防止整个连接反应的体系有问题。
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