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如何防止连接过程中载体发生自连
为什么碱性磷酸酶处理可以
防止
质粒
载体
DNA
自连
的作用
答:
碱性磷酸酶可以去除DNA断裂处的5'端的磷酸基团。5'端的磷酸基团对于DNA连接是必须的,
用碱性磷酸酶处理切开的载体后
,载体不能在DNA连接酶的作用下自连,而目的基因片段两端是有5'端的磷酸基团的,可以在DNA连接酶的作用下与载体连接。所以碱性磷酸酶处理可以防止质粒载体DNA自连的作用。 本回答由提问者推荐 举报| ...
...单酶切后
怎么
把目的基因连到已经酶切过的
载体
上
如何防止自连
...
答:
单酶切要想防止自连,
最好的办法是把载体酶切产物脱磷酸
。脱了磷酸的载体就无法自连,它只能和目的片段连接。如果不想脱磷,可以在连接反应体系中加大目的片段的数量,提高阳性克隆的比例,但这不能完全避免自连。不过最好的办法还是
做双酶切
。单酶切连接实在麻烦。
如何避免载体自连
现象
答:
碱性磷酸酶处理切开的载体
~可减少自连的产生~再一点双酶切要充分~可先做一个小切的预实验~
再次请教生物问题
答:
这些没有切动的载体转化率是非常高的,这是转化过程中假阳性的最大来源。载体自连最容易发生的情况有两种,
一种是单酶切
,一种是平末端连接。这两种情况下,通常为了防止载体自连会对酶切后的载体使用
碱性磷酸酶处理
,将DNA 5‘端的-P基团置换成-OH,这样会一定程度的防止载体自连。
基因工程中
如何避免载体
的自我环化和目的基因的双向插入?
答:
双酶切。在基因两端分别用不同的内切酶来酶切,
载体
上也用这两种酶来酶切。这样自己的酶切位点只能识别自己的位点,就不会
发生
基因方向的错误了。而且载体的两个位点互相不识别,也不会
自连接
。
为什么碱性磷酸酶处理可以
防止
质粒
载体
DNA
自连
的作用
答:
因为5撇磷酸的存在,才能和另一个片段的3-OH发生缩合脱水反应,也就是自连作用 碱性磷酸酶可以去除DNA断裂处的5撇端的磷酸基团。用
碱性磷酸酶处理
切开的载体后不会发生缩合反应,所以碱性磷酸酶处理可以防止质粒载体DNA自连的作用。
如何
提高DNA平端
连接
的效率?
答:
1、低温下长时间的
连接
效率比室温下短时间连接的好。2、在体系中加一点切载体的酶,只要连接后原来的酶切位点消失。这样可
避免载体自连
,应该可以大大提高平端连接的效率。3、足够多的载体和插入片段是最重要的 。生物帮上面有这方面的专题介绍,原位杂交,荧光原位杂交,荧光原位杂交技术,荧光原位杂交...
...检外源DNA其优点可以
防止
质粒和含同的基因的外源DNA片段自身环化_百...
答:
每种限制性内切酶的酶切位点是不一样的,因此,不同的酶切位点不能连到一起,相同的才可以。用不同的切,到
连接
的时候,可以有效
防止载体自连
,只能让外源DNA片段和载体之间那相同的酶切位点相互连接。
【求助/交流】平末端必须去磷酸化吗
答:
!!chenliang_0513(站内联系TA)肯定是没有必要的ben1147(站内联系TA)在载体两端都是平末端的时候,去磷酸化
防止载体自连
如果一端平,一端粘性末端的话就不用,因为不会自连 在载体两端都是平末端的时候,去磷酸化防止载体自连
为什么碱性磷酸酶处理可以
防止
质粒
载体
DNA
自连
的作用
答:
DNA
连接
需要自由的磷酸和羟基反映,去磷酸化后
载体
的末端都没有磷酸就不能连接了。而连接片段时,由片段上提供磷酸,所以还能连接
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